El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de<em> Coxiella burnetii</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Coxiella burnetii, el agente que causa la fiebre Q, es una bacteria intracelular obligado. Ensayos de diagnóstico basado en la PCR se han desarrollado para la detección de C. ADN burnetii en cultivos celulares y muestras clínicas. PCR requiere un equipo especializado y una amplia formación de usuario final, y por lo tanto, no es adecuado para el trabajo de rutina especialmente en un área de recursos limitados. Hemos desarrollado un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para detectar la presencia de C. burnetii en muestras de pacientes. Este método se realiza a una única temperatura de alrededor de 60 ° C en un baño de agua o un bloque de calentamiento. La sensibilidad de este ensayo LAMP es muy similar a la PCR con un límite de detección de aproximadamente 25 copias por reacción. Este informe describe la preparación de la reacción usando reactivos liofilizados y visualización de los resultados utilizando azul de hidroxinaftol (HNB) o una lámpara de UV con colorante intercalante fluorescente en la reacción. Los reactivos de LAMP fueron lyophilizeta y se almacena a temperatura ambiente (RT) durante un mes, sin pérdida de sensibilidad de detección. Este ensayo LAMP es particularmente robusto porque la preparación de la mezcla de reacción no implica pasos complejos. Este método es ideal para su uso en entornos con recursos limitados donde la fiebre Q es endémica.
Introduction
La pequeña bacteria Gram-negativa Coxiella burnetii es el agente causante de la fiebre Q, que es una zoonosis en todo el mundo. Debido a la distribución mundial de la fiebre Q y la alta infectividad de C. burnetii, personal militar y civil de Estados Unidos desplegadas en el extranjero están en riesgo de ser infectados en las áreas endémicas.
La fiebre Q se manifiesta en dos formas: infecciones agudas y crónicas. La fiebre Q aguda se presenta con síntomas similares a la gripe, hepatitis, o la neumonía, y suele ser una enfermedad autolimitada con una baja tasa de mortalidad. Q-fiebre crónica, mientras que menos frecuente, a menudo resulta en endocarditis, que tiene una tasa de mortalidad mucho más alta si se deja sin tratamiento 1,2. Por lo tanto, el diagnóstico precoz para guiar un tratamiento adecuado es fundamental para el cuidado del paciente. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se han desarrollado ensayos para la detección de C. ADN burnetii en cultivos celulares y muestras clínicas 3-5 </ Sup>. Tanto PCR y qPCR son costosos ya menudo no es fácilmente disponible en las zonas con recursos limitados para el trabajo de rutina.
Originalmente descrito por Notomi 6, amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) ofrece un método de amplificación de ADN alternativo. Lámpara utiliza ADN polimerasa Bst para la síntesis de ADN de desplazamiento de cadena junto con conjuntos de cebadores especialmente diseñados que reconocen al menos seis regiones independientes del gen diana. La ventaja más significativa de LAMP es que la amplificación se produce en condiciones isotérmicas. Por lo tanto, sólo se requiere un baño de agua, calentador o una incubadora. Este método ha sido utilizado para detectar varios patógenos rickettsias 7-9. La visualización de los productos de ADN amplificados por electroforesis en gel es el método más preciso que puede diferenciar verdaderos positivos de falsos positivos debido a la amplificación no específica. Sin embargo, los procedimientos involucrados en la electroforesis en gel no son prácticos para ar de recursos limitadosEAS. Varios métodos alternativos han sido desarrollados para detectar los productos de reacción. Estos alternativa, como turbidez derivado de la formación de pirofosfato de magnesio 10 o el uso de un colorante intercalante fluorescente para ser visualizado con luz UV 11,12 son más favorables que la ejecución de un gel. Los reactivos de LAMP fueron estables durante un mes cuando se almacenaron a 25 ° C y 37 ° C, que son las temperaturas ambiente en los países tropicales y subtropicales donde la fiebre Q es endémica 13.
Un ensayo de lámpara fue desarrollado en nuestro laboratorio para detectar la presencia de C. burnetii en muestras de plasma 14. Aquí se describe un protocolo sencillo para la preparación de la mezcla de reacción LAMP a partir de los reactivos liofilizados. Los reactivos liofilizados son estables durante un mes cuando se almacena a temperatura ambiente. Cuando se combina con un método de visualización fácil, esto es un método ideal para usar para la detección de C. burnetii en un entorno de recursos limitados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anteriormente, hemos desarrollado un ensayo de lámpara sensible y específico de orientación del elemento de inserción 14 IS1111a. El elemento IS1111 fue seleccionado porque es muy conservadas entre las diferentes cepas de C. burnetii y su alto número de copias (7-110) en la bacteria (Klee 2006). Nuestros resultados muestran que la lámpara puede detectar aproximadamente 25 copias del elemento IS1111, que puede correlacionarse con tan poco como una copia cromosómica de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Centro de Investigación Médica de la Marina, la unidad de trabajo de investigación 6000.RAD1.J.A0310. Las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan necesariamente la política oficial o la posición del Departamento de la Marina, el Departamento de Defensa, o el gobierno de Estados Unidos. Wei Mei-Ching es un empleado del gobierno de Estados Unidos. Este trabajo fue preparado como parte de sus funciones oficiales. Título 17 USC §105 establece que "La protección de copyright bajo este título no está disponible para toda la obra del Gobierno de los Estados Unidos. ' Título 17 USC § 101 define una obra gobierno de Estados Unidos como un trabajo preparado por miembro del servicio militar o empleado del gobierno de Estados Unidos como parte de las funciones oficiales de esa persona.
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
