की जांच के लिए Lyophilized लूप की मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन अभिकर्मकों का विकास<em> Coxiella burnetii</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Coxiella burnetii, एजेंट क्यू बुखार के कारण, एक लाचार intracellular जीवाणु है। पीसीआर आधारित नैदानिक assays सी का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है सेल संस्कृतियों और नैदानिक नमूनों में burnetii डीएनए। पीसीआर विशेष उपकरणों और व्यापक अंत उपयोगकर्ता के प्रशिक्षण की आवश्यकता है, और इसलिए, यह नियमित काम विशेष रूप से एक संसाधन विवश क्षेत्र में के लिए उपयुक्त नहीं है। हम एक पाश की मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (दीपक) परख सी की मौजूदगी का पता लगाने के लिए विकसित किया है रोगी के नमूनों में burnetii। इस पद्धति का एक पानी के स्नान या हीटिंग ब्लॉक में लगभग 60 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर एक भी किया जाता है। इस चिराग परख की संवेदनशीलता प्रतिक्रिया प्रति के बारे में 25 प्रतियों की एक सीमा का पता लगाने के साथ पीसीआर के समान है। इस रिपोर्ट में यह प्रतिक्रिया lyophilized अभिकर्मकों और hydroxynaphthol नीला (एचएनबी) या प्रतिक्रिया में फ्लोरोसेंट intercalating डाई के साथ एक यूवी लैंप का उपयोग कर परिणाम के दृश्य का उपयोग करने की तैयारी का वर्णन है। दीपक अभिकर्मकों lyophili थेजेड और संवेदनशीलता का पता लगाने की हानि के बिना एक महीने के लिए कमरे के तापमान (आर टी) में संग्रहीत। इस चिराग परख विशेष रूप से मजबूत है क्योंकि प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करने के लिए जटिल कदम को शामिल नहीं करता है। इस विधि में संसाधन सीमित सेटिंग में उपयोग जहां क्यू बुखार स्थानिक है के लिए आदर्श है।
Introduction
छोटे ग्राम नकारात्मक जीवाणु Coxiella burnetii क्यू बुखार है, जो दुनिया भर में एक जॉनोसिस है की प्रेरणा का एजेंट है। क्यू बुखार के दुनिया भर में वितरण और सी के उच्च संक्रामकता के कारण burnetii, विदेशों में तैनात अमेरिकी सैन्य और असैनिक कर्मियों स्थानिक क्षेत्रों में संक्रमित होने का खतरा होता है।
तीव्र और जीर्ण संक्रमण: क्यू बुखार के दो रूपों में प्रकट होता है। एक्यूट क्यू बुखार फ्लू जैसे लक्षण, हेपेटाइटिस, या निमोनिया के साथ खुद को प्रस्तुत करता है, और आमतौर पर एक खुद को सीमित एक कम मृत्यु दर के साथ बीमारी है। जीर्ण क्यू बुखार, जबकि कम प्रचलित है, अक्सर अन्तर्हृद्शोथ है, जो एक बहुत अधिक मृत्यु दर है अगर अनुपचारित छोड़ दिया 1,2 में यह परिणाम है। इसलिए, शीघ्र निदान का मार्गदर्शन करने के लिए एक उचित इलाज के लिए रोगी की देखभाल के लिए महत्वपूर्ण है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) assays सी का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है सेल संस्कृतियों और नैदानिक नमूनों 3-5 <में burnetii डीएनए/ Sup>। दोनों पीसीआर और qPCR महंगा है और अक्सर आसानी से नियमित काम के लिए संसाधन विवश क्षेत्रों में उपलब्ध नहीं हैं।
मूलतः Notomi 6 से वर्णित है, लूप की मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (दीपक) एक वैकल्पिक डीएनए प्रवर्धन विधि प्रदान करता है। दीपक विशेष रूप से डिजाइन प्राइमर सेट है कि लक्ष्य जीन की कम से कम छह स्वतंत्र क्षेत्रों को पहचान के साथ-साथ कतरा विस्थापन डीएनए संश्लेषण के लिए Bst डीएनए पोलीमरेज़ उपयोग करता है। दीपक की सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि प्रवर्धन इज़ोटेर्माल स्थितियों के कारण होती है। इसलिए, केवल एक पानी के स्नान, हीटिंग ब्लॉक या एक मशीन की आवश्यकता है। इस विधि के कई rickettsial रोगजनकों 7-9 पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। जेल वैद्युतकणसंचलन से परिलक्षित डीएनए उत्पादों के दृश्य के लिए सबसे सही तरीका है जिसके अविशिष्ट प्रवर्धन के कारण झूठी सकारात्मक से सच सकारात्मक अंतर कर सकते है। हालांकि प्रक्रियाओं जेल वैद्युतकणसंचलन में शामिल संसाधन सीमित की गिरफ्तारी के लिए व्यावहारिक नहीं हैंईएएस। कई वैकल्पिक तरीकों प्रतिक्रिया उत्पादों का पता लगाने के लिए विकसित किए गए। ये विकल्प, जैसे मैग्नीशियम पाइरोफॉस्फेट गठन के 10 या एक फ्लोरोसेंट intercalating डाई का उपयोग करने से निकाली गई गंदगी को पराबैंगनी प्रकाश 11,12 के तहत कल्पना करने के लिए एक जेल चलाने की तुलना में अधिक अनुकूल हैं। जब 25 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है, जो उष्णकटिबंधीय और उप उष्णकटिबंधीय देशों में परिवेश तापमान रहे हैं, जहां क्यू बुखार स्थानिक 13 है दीपक अभिकर्मकों एक महीने के लिए स्थिर थे।
एक दीपक परख हमारी प्रयोगशाला में विकसित किया गया था सी की मौजूदगी का पता लगाने के लिए प्लाज्मा के नमूने 14 में burnetii। यहाँ हम lyophilized अभिकर्मकों से दीपक प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन। lyophilized अभिकर्मकों एक महीने के लिए स्थिर जब आरटी पर संग्रहीत कर रहे हैं। जब एक आसान दृश्य विधि के साथ संयुक्त, इस सी का पता लगाने के लिए उपयोग करने के लिए एक आदर्श तरीका है एक संसाधन सीमित सेटिंग में burnetii।
Protocol
Representative Results
Discussion
इससे पहले, हम एक संवेदनशील और विशिष्ट दीपक परख प्रविष्टि तत्व IS1111a 14 को निशाना बनाने का विकास किया। IS1111 तत्व का चयन किया गया है क्योंकि यह अत्यधिक सी के विभिन्न प्रकारों के बीच में संरक्षित ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध नौसेना चिकित्सा अनुसंधान केन्द्र, अनुसंधान कार्य इकाई 6000.RAD1.J.A0310 द्वारा समर्थित किया गया। इस लेख में व्यक्त विचार लेखक के हैं और इनका सरकारी नीति या नौसेना, रक्षा विभाग, या अमेरिकी सरकार ने विभाग की स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं करते। वी-मेई चिंग अमेरिकी सरकार के एक कर्मचारी है। इस काम के लिए उसे सरकारी कर्तव्यों के भाग के रूप में तैयार किया गया था। शीर्षक 17 यूएससी §105 कि 'इस शीर्षक के अंतर्गत कॉपीराइट संरक्षण के संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार किसी भी काम के लिए उपलब्ध नहीं है।' प्रदान करता है शीर्षक 17 यूएससी §101 उस व्यक्ति के सरकारी कर्तव्यों के भाग के रूप में सैन्य सेवा के सदस्य या अमेरिकी सरकार के कर्मचारी द्वारा तैयार एक काम के रूप में एक अमेरिकी सरकार के काम को परिभाषित करता है।
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
