Utvecklingen av lyofiliserad Loop-medie Isothermal amplifieringsreagenserna för detektion av<em> Coxiella burnetii</em
Summary
We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.
Abstract
Coxiella burnetii, agenten som orsakar Q-feber, är en obligat intracellulär bakterie. PCR-baserade diagnostiska analyser har utvecklats för att detektera C. burnetii-DNA i cellkulturer och kliniska prover. PCR kräver specialutrustning och omfattande slutanvändarutbildning, och därför är det inte lämpligt för rutinarbete, särskilt i en resurs begränsade område. Vi har utvecklat en loop-medierad isotermisk amplifiering (LAMP) analys för att detektera närvaron av C. burnetii i patientprover. Denna metod utförs vid en enda temperatur omkring 60 ° C i ett vattenbad eller värmeblock. Känsligheten hos denna LAMP-analysen är mycket lik PCR med en detektionsgräns av ca 25 kopior per reaktion. Denna rapport beskriver framställningen av reaktionen med hjälp av frystorkade reagens och visualisering av resultat med hjälp av hydroxynaphthol blå (HNB) eller en UV-lampa med fluorescerande interkalerande färgämne i reaktionen. Lampan reagens var lyophilized och förvarades vid rumstemperatur (RT) under en månad utan förlust av detektionskänslighet. Denna lampa analys är särskilt robust, eftersom reaktionsblandningen preparatet inte medför komplicerade steg. Denna metod är idealisk för användning i resursbegränsade miljöer där Q-feber är endemisk.
Introduction
Den lilla gramnegativ bakterie Coxiella burnetii är det orsakande medlet av Q-feber, som är en världsomspännande zoonos. På grund av Q-feber världsomspännande distribution och den höga smittsamheten C. burnetii, USA: s militära och civila personal som utstationeras utomlands löper risk att smittas i de endemiska områden.
Q-feber manifesteras i två former: akuta och kroniska infektioner. Akut Q-feber presenterar sig med influensaliknande symptom, hepatit eller lunginflammation, och är vanligtvis en självbegränsande sjukdom med en låg dödlighet. Kronisk Q-feber, medan mindre vanliga, ofta resulterar i endokardit, som har en mycket högre dödlighet om de lämnas obehandlade 1,2. Därför tidig diagnos styra en lämplig behandling är avgörande för patientens vård. Polymerase Chain Reaction (PCR) och kvantitativ realtids-PCR (qPCR) analyser har utvecklats för att detektera C. burnetii-DNA i cellkulturer och kliniska prover 3-5 </ Sup>. Både PCR och qPCR är kostsamma och ofta inte lätt tillgänglig i resursbegränsade områden för rutinarbete.
Ursprungligen beskrevs av Notomi 6, loop-medierad isotermiska förstärkning (LAMP) erbjuder ett alternativ DNA-förstärkning metod. LAMP använder Bst DNA-polymeras för strängförskjutning DNA-syntes tillsammans med specialdesignade primeruppsättningar som känner igen åtminstone sex oberoende regioner i målgenen. Den mest betydande fördelen med LAMP är att amplifiering sker under isoterma förhållanden. Därför krävs endast ett vattenbad, värmeblock eller en inkubator. Denna metod har använts för att detektera flera Rickettsia patogener 7-9. Visualisering av amplifierade DNA-produkter genom gelelektrofores är den mest exakta metod som kan skilja sant positiva från falska positiva på grund av ospecifik förstärkning. Men förfarandet i samband gelelektrofores är inte praktiskt för resursbegränsade arEAS. Flera alternativa metoder utvecklades för att detektera reaktionsprodukterna. Dessa alternativ, såsom grumlighet härrörande från magnesium pyrobildning 10 eller med hjälp av en fluorescerande interkalerande färgämne för att synliggöras under UV-ljus 11,12 är mer gynnsamma än att köra en gel. Lampan reagens var stabila under en månad vid förvaring vid 25 ° C och 37 ° C, som är omgivningstemperaturer i tropiska och subtropiska länder där Q-feber är endemisk 13.
En LAMP analys utvecklades i vårt laboratorium för att detektera närvaron av C. burnetii i plasmaprover 14. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för framställningen av LAMP-reaktionsblandningen från de lyofiliserade reagensen. De frystorkade reagens är stabil i en månad vid förvaring vid rumstemperatur. I kombination med en enkel visualisering metod, är detta en idealisk metod att använda för att detektera C. burnetii i en resursbegränsad inställning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidigare har vi utvecklat en känslig och specifik LAMP analys med inriktning på insättningselementet IS1111a 14. Den IS1111 elementet valdes eftersom det är mycket konserverad bland de olika stammar av C. burnetii och dess höga antal kopior (7-110) i bakterier (Klee 2006). Våra resultat visade att LAMP kan detektera ungefär 25 kopior av IS1111 elementet, vilket kan korrelera till så lite som en kromosomal kopia av Coxiella DNA. I denna studie var Bst</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av Naval Medical Research Center, forskning arbetsenhet 6000.RAD1.J.A0310. De åsikter som uttrycks i artikeln är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis den officiella politiken eller position Institutionen för marinen, försvarsdepartementet, eller den amerikanska regeringen. Wei Mei Ching är anställd av den amerikanska regeringen. Detta arbete framställdes som en del av sina officiella plikter. Avdelning 17 USC §105 att "det upphovsrättsliga skyddet enligt denna avdelning finns inte tillgängligt för något arbete av Förenta staternas regering." Avdelning 17 USC §101 definierar en amerikanska regeringen arbete som arbete som skall utföras av militärtjänst medlem eller anställd av den amerikanska regeringen som en del av personens tjänsteplikt.
Materials
| LAMP primers | Eurofins MWG operon | 10 nmol, salt free | Sequence designed by customer |
| Bst DNA polymerase | New England Biolabs | M0275L | 8 units/ml |
| 10X Thermo pol buffer | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP mixture | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M, Trimethylglycine |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10X Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | gel loading buffer |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000X, visualize products in tubes |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000X, visualize products in gels |
| Lyophilized reagents | Gene Reach | ||
| Hydroxynaphthol blue | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant tube scanner | Qiagen | real-time detection |
References
- Anderson, A., et al. Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group. MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).
- Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis. Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).
- Fournier, P. E., Raoult, D. Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever. J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).
- Schneeberger, P. M., et al. Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).
- Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia. Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
- Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).
- Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).
- Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Qiao, Y. M., et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores. Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Thekisoe, O. M., et al. Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates. J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).
- Chen, H. W., Ching, W. M. Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii. J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).
- Wang, D., et al. A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria. Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).
