उच्च throughput CRISPR वेक्टर निर्माण और डीएनए संशोधनों की विशेषता टमाटर रोंआर जड़ें की पीढ़ी द्वारा
Summary
डीएनए विधानसभा का प्रयोग, कई CRISPR वैक्टर एक भी क्लोनिंग प्रतिक्रिया में समानांतर में निर्माण किया जा सकता, CRISPR की बड़ी संख्या के निर्माण बनाने के लिए एक आसान काम वैक्टर। टमाटर बालों की जड़ों CRISPR वैक्टर मान्य है और उत्परिवर्ती सामग्री उत्पन्न करने के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली रहे हैं।
Abstract
Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.
Introduction
CRISPR के साथ लक्षित डीएनए संशोधनों उत्पन्न करने की क्षमता / Cas9 कार्यात्मक जीनोमिक्स के अध्ययन के लिए महान क्षमता है। वहाँ CRISPR / Cas9 प्रणाली के दो घटक हैं; Cas9 nuclease, Staphylococcus प्योगेनेस और एक लगभग 100-NT गाइड आरएनए (gRNA) अणु है कि लक्षित डीएनए साइट (ओं) के लिए 1 Cas9 निर्देशन से निकाली गई। लक्ष्य मान्यता पहले द्वारा प्रदत्त है ~ gRNA, जो लक्षित कर वैक्टर 2,3 के उच्च throughput उत्पादन के लिए अनुमति देता है के 20-NT। अधिकांश जीवों कि इंजीनियर हो सकता है, पहले से ही CRISPR / Cas9 प्रौद्योगिकी 4,5 के साथ किया गया है।
पौधों, ऐसे CaMV 35S प्रमोटर के रूप में विधान प्रवर्तकों में, आमतौर पर Cas9 nuclease 6 की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। gRNAs आरएनए पोलीमर्स III U6 या U3 प्रमोटरों जो gRNA की पहली आधार प्रतिबंधित का उपयोग कर व्यक्त कर रहे हैं करने के लिए या तो एक जी, U6, या u3 के लिए एक कुशल, प्रतिलेखन के लिए के लिए। हालांकि शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के सालाना जलसेoters है, जो इन प्रतिबंधों से मुक्त कर रहे हैं, भी 7.8 इस्तेमाल किया गया है।
विभिन्न gRNAs अलग क्षमता के साथ डीएनए उत्परिवर्तन प्रेरित है, और इसलिए यह पहली बार पूरे संयंत्र परिवर्तनों में निवेश या व्यापक प्ररूपी स्क्रीन स्थापित करने से पहले CRISPR वैक्टर मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। CRISPR की क्षणिक अभिव्यक्ति, पौधों में constructs उदाहरण के लिए agroinfiltration का उपयोग करके, स्थिर पौधों 6 की तुलना में, मुश्किल म्यूटेशन और इस तरह के दृष्टिकोण के साथ अव्यावहारिक प्ररूपी assays का पता लगाने कर रही है आम तौर पर डीएनए संशोधन का एक कम आवृत्ति में परिणाम है। बालों की जड़ों तथाकथित एक सुविधाजनक, वैकल्पिक प्रणाली के बाद से स्वतंत्र, स्थिरतापूर्वक तब्दील सामग्री की एक बड़ी संख्या है, के रूप में स्थिर संयंत्रों के लिए महीने में करने का विरोध सप्ताह के भीतर उत्पन्न किया जा सकता हैं। CRISPR वैक्टर बालों की जड़ों 9,10 में डीएनए उत्परिवर्तन उत्प्रेरण में बहुत प्रभावी रहे हैं।
डीएनए विधानसभा तरीकों कुशलता से डीएनए overl युक्त टुकड़े ligateapping समाप्त होता है 11। कुछ डीएनए विधानसभा तरीकों का एक प्रमुख लाभ इकट्ठे उत्पादों में ssDNA (यानी, ओलिगोस) को शामिल करने की क्षमता है। चूंकि gRNAs केवल ~ 20-NT लंबे होते हैं और नए लक्ष्य संश्लेषित ओलिगोस के साथ बनाया जा सकता है, इन डीएनए विधानसभा तरीकों अच्छी तरह से CRISPR क्लोनिंग के लिए अनुकूल हैं। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल गया है कि सफलतापूर्वक सोयाबीन 10, चिनार 12 में इस्तेमाल किया और अब टमाटर की गई CRISPR वैक्टर p201 श्रृंखला पर आधारित हैं। प्रस्तुत क्लोनिंग प्रक्रिया चालू क्लोनिंग विधि 10 पर कई लाभ प्रदान करता है। अर्थात्, पूरी तरह कार्यात्मक वैक्टर एक ही दिन में एक भी क्लोनिंग प्रतिक्रिया में उत्पन्न किया जा सकता है। वेक्टर निर्माण भी आगे हाथ पर समय और माल की लागत को कम करने, समानांतर में कई CRISPR वैक्टर उत्पन्न करने के लिए जमा किया जा सकता है। हम यह भी एक कारगर तरीका लक्षित जीन विलोपन के साथ ट्रांसजेनिक सामग्री का उत्पादन करने के लिए के रूप में टमाटर बालों की जड़ों की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। बालों की जड़ों को वैध करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंCRISPR वैक्टर खाया और बाद के प्रयोगों के लिए सामग्री प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
Since DNA assembly is used to recombine any overlapping DNA sequences, this cloning method can be applied to any CRISPR vector construction. Most CRISPR cloning schemes use either gene synthesis of the gRNA, type IIS restriction enzymes17,18, or overlap-extension PCR19. Each of these techniques has inherent advantages and disadvantages, but they typically require multiple hands-on cloning steps. The primary advantage of the cloning method presented here is that the entire process occurs in a single,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान IOS-1025642 (जीबीएम) द्वारा समर्थित किया गया। हम ARqua1 तनाव प्रदान करने के लिए मारिया हैरिसन धन्यवाद।
Materials
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' -> 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGAAATTTATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTGAAG | ||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT | ||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTCAAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTAGATGT | ||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTATCCCTAG | Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. | |||
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