Высокая пропускная способность CRISPR Конструирование вектора и характеристика ДНК Модификации генерацией Томатный волосистых корней
Summary
Используя сборку ДНК, несколько векторов CRISPR могут быть построены параллельно в одной реакции клонирования, что делает строительство большого числа CRISPR векторов простую задачу. Томатные волосатые корни отличная модель системы для проверки CRISPR векторов и генерировать мутантные материалы.
Abstract
Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.
Introduction
Способность генерировать адресные модификации ДНК с CRISPR / cas9 имеет большой потенциал для функциональной геномики исследований. Есть два компонента системы CRISPR / cas9; cas9 нуклеазы, полученный из Staphylococcus Пирролидонилпептидаза и приблизительно 100-нт руководство РНК (gRNA) молекулы , которая направляет cas9 на сайт целевой ДНК (ов) 1. Целевой показатель признания присуждается первым ~ 20-нт из gRNA, что позволяет продукции с высокой пропускной способностью адресности векторов 2,3. Большинство организмов , которые могут быть созданы, уже были с CRISPR технологии / cas9 4,5.
В растениях, конститутивные промоторы, такие как промотор CaMV 35S, которые обычно используются для управления экспрессией в cas9 нуклеазы 6. В gRNAs выражаются с помощью РНК-полимеразы III U6 или промоторы U3, который ограничивает первую базу gRNA либо к G, для U6 или для У3, для эффективной транскрипции. Однако РНК-полимеразы II выпускного вечераoters, которые свободны от этих ограничений, также были использованы 7,8.
Различные gRNAs вызывают мутации ДНК с различной эффективностью, и поэтому он может быть важно сначала проверить CRISPR векторов, прежде чем инвестировать в преобразования целого растения или создание обширных фенотипические экранов. Переходная экспрессия CRISPR конструкций в растениях, используя агроинфильтрации например, как правило , приводит к более низкой частоте модификации ДНК по сравнению с устойчивыми растениями 6, что делает обнаружение мутаций трудно и фенотипических анализов непрактичными с такими подходами. Так называемые волосатых корней являются удобной, альтернативная система, так как большое число независимых, стабильно трансформированных материалов могут быть получены в течение нескольких недель, в отличие от месяцев для стабильных растений. CRISPR векторы очень эффективны при индукции мутаций ДНК в волосатых корней 9,10.
методы сборки ДНК эффективно лигирования фрагменты ДНК, содержащие overlapping заканчивается 11. Основным преимуществом некоторых методов сборки ДНК является способность включать оцДНК (т.е. олиго) в собранных продуктах. Так как gRNAs только ~ 20-нт долго и новые цели могут быть сделаны с синтезированных олигонуклеотидов, эти методы сборки ДНК хорошо подходят для CRISPR клонирования. Протоколы , описанные здесь , основаны на P201 серии CRISPR векторов, которая успешно используется в сое 10, 12 тополя и теперь помидор. Процедура клонирования представлены предлагает несколько преимуществ по сравнению с текущим методом клонирования 10. А именно, полностью функциональные векторы могут быть получены в одной реакции клонирования в течение одного дня. Вектор строительства также могут быть объединены для создания нескольких векторов CRISPR параллельно, дальнейшее сокращение практического времени и материальных затрат. Мы также приводим протокол для генерации томатных волосатых корней как эффективный способ для получения трансгенных материалов с целевым делеции гена. Волосатые корни используются для действительныйели векторы CRISPR и дают материал для последующих экспериментов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Since DNA assembly is used to recombine any overlapping DNA sequences, this cloning method can be applied to any CRISPR vector construction. Most CRISPR cloning schemes use either gene synthesis of the gRNA, type IIS restriction enzymes17,18, or overlap-extension PCR19. Each of these techniques has inherent advantages and disadvantages, but they typically require multiple hands-on cloning steps. The primary advantage of the cloning method presented here is that the entire process occurs in a single,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом Национального научного фонда IOS-1025642 (GBM). Мы благодарим Марию Харрисона за предоставление штамма ARqua1.
Materials
| NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
| EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
| StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
| MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
| Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
| GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
| Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
| Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
| Primers 5' -> 3' | |||
| SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGAAATTTATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTGAAG | ||
| ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT | ||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTCAAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTAGATGT | ||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTATCCCTAG | Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
| UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. | |||
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
- Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
- Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
- Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
- Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
- Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA – A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
- Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
- Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
- Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
- Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
- Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).
