Ved hjelp av DNA-sammenstillingen, kan flere CRISPR vektorer konstrueres i parallell i et enkelt klonings reaksjon, noe som gjør konstruksjonen av et stort antall vektorer CRISPR en enkel oppgave. Tomat hårete røtter er en utmerket modellsystem for å validere CRISPR vektorer og generere mutante materialer.
Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.
Evnen til å generere målrettede DNA modifikasjoner med CRISPR / Cas9 har stort potensial for funksjonell genomstudier. Det er to komponenter av CRISPR / Cas9 system; den Cas9 nuklease, avledet fra Staphylococcus pyogenes og en ca 100-nt guide RNA (gRNA) molekyl som dirigerer Cas9 til målrettede DNA nettsted (er) 1. Målgjenkjenning er gitt av den første ~ 20-nt av gRNA, som gir mulighet for high-throughput produksjon av målretting vektorer 2,3. De fleste organismer som kan være konstruert, allerede har vært med CRISPR / Cas9 teknologi 4,5.
I planter, konstitutive promotorer, slik som CaMV 35S-promoteren, blir ofte anvendt for å drive ekspresjonen av Cas9 nuklease 6. De gRNAs uttrykkes ved hjelp av RNA-polymerase III-U6 eller U3 promotorer som begrenser den første basen av gRNA til enten en G, for U6, eller A for U3, for effektiv transkripsjon. Men RNA polymerase II promoters, som er fri for disse begrensningene, er også blitt anvendt 7,8.
Ulike gRNAs indusere DNA mutasjoner med ulik effektivitet, og så det kan være viktig å først validere CRISPR svektorer før du investerer i hel-anlegget transformasjoner eller sette opp store fenotypiske skjermer. Transient ekspresjon av CRISPR konstruerer i planter, ved hjelp av agroinfiltration for eksempel, vanligvis resulterer i en lavere hyppighet av DNA modifikasjon i forhold til stabile planter 6, noe som gjør deteksjon av mutasjoner vanskelige og fenotypiske analyser upraktisk med slike tilnærminger. Såkalte hårete røtter er en enkel, alternativt system ettersom et stort antall av uavhengige, stabilt transformerte materialer kan genereres i løpet av uker, i motsetning til måneder for stabile planter. CRISPR vektorer er svært effektiv på å indusere DNA mutasjoner i hårete røtter 9,10.
DNA monteringsmetoder effektivt ligere DNA-fragmenter som inneholder overlapping slutter 11. En stor fordel med enkelte DNA montering metoder er evnen til å inkorporere ssDNA (dvs. oligoer) inn i de sammenstilte produkter. Siden gRNAs er bare ~ 20-nt lang og nye mål kan fremstilles med syntetiske oligonukleotider, DNA disse monteringsmetoder er velegnet til å CRISPR kloning. Protokollene er beskrevet her er basert på P201 serie CRISPR vektorer som har blitt brukt i soya 10, poppel 12 og nå tomat. Kloningsprosedyren presentert tilbyr flere fordeler i forhold til dagens kloningsfremgangsmåten 10. Nemlig, kan fullt ut funksjonell vektorer bli generert i et enkelt klonings reaksjon på en enkelt dag. Vector konstruksjon kan også bli slått sammen for å generere flere CRISPR vektorer i parallell, noe som ytterligere reduserer hands-on tid og materialkostnader. Vi presenterer også en protokoll for generering av tomat hårete røtter som en effektiv metode for å fremstille transgene materialer med målrettede genet delesjoner. Hårete røtter blir brukt til gyldigspiste CRISPR vektorer og gi materiale for etterfølgende eksperimenter.
Since DNA assembly is used to recombine any overlapping DNA sequences, this cloning method can be applied to any CRISPR vector construction. Most CRISPR cloning schemes use either gene synthesis of the gRNA, type IIS restriction enzymes17,18, or overlap-extension PCR19. Each of these techniques has inherent advantages and disadvantages, but they typically require multiple hands-on cloning steps. The primary advantage of the cloning method presented here is that the entire process occurs in a single,…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av National Science Foundation tilskudd IOS-1025642 (GBM). Vi takker Maria Harrison for å gi ARqua1 belastning.
NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
Primers 5' -> 3' | |||
SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGAAATTTATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTGAAG | ||
ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT | ||
SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTCAAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTAGATGT | ||
ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTATCCCTAG | Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |