Med användning av DNA montering, kan flera crispr vektorer konstrueras parallellt i en enda kloningsreaktion, vilket gör konstruktionen av ett stort antal crispr vektorer en enkel uppgift. Tomat håriga rötter är ett utmärkt modellsystem för att validera crispr vektorer och generera muterade material.
Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.
Förmågan att generera riktade DNA-ändringar med crispr / Cas9 har stor potential för funktionsgenomik studier. Det finns två komponenter i crispr / Cas9 systemet; den Cas9 nukleas, härledd från Staphylococcus pyogenes och ett ungefär 100-nt guide RNA (gRNA) molekyl som styr Cas9 till den målsökta DNA-ställe (n) 1. Måligenkännande ges av den första ~ 20 nt av gRNA, vilket möjliggör hög kapacitet produktion av målstyrningsvektorer 2,3. De flesta organismer som kan manipuleras, redan har varit med crispr / Cas9 teknik 4,5.
I växter, konstitutiva promotorer, såsom CaMV 35S-promotorn, används vanligen för att driva expressionen av Cas9 nukleas 6. De gRNAs uttrycks enligt de RNA-polymeras III U6 eller U3 promotorer som begränsar den första basen av gRNA till antingen ett G, för U6, eller A för U3, för effektiv transkription. Dock RNA-polymeras II promoters, som är fria från dessa begränsningar, har också använts 7,8.
Olika gRNAs inducerar DNA-mutationer med olika verkningsgrader, så det kan vara viktigt att först validera crispr vektorer innan man investerar i hel-växt transformationer eller inrätta omfattande fenotypiska skärmar. Transient uttryck av crispr konstruktioner i växter, genom att använda agroinfiltration till exempel i allmänhet resulterar i en lägre frekvens av DNA-modifiering jämfört med stabila växter 6, vilket gör detektion av mutationer svåra och fenotypiska analyser opraktiska med sådana metoder. Så kallade håriga rötter är ett bekvämt, alternativt system eftersom ett stort antal av oberoende, stabilt transformerade material kan genereras inom veckor, i motsats till månader för stabila växter. Crispr vektorer är mycket effektiva i att inducera DNA-mutationer i håriga rötter 9,10.
DNA monteringsmetoder ligera effektivt DNA-fragment som innehåller overlapping ändar 11. En stor fördel med vissa DNA monteringsmetoder är möjligheten att införliva ssDNA (dvs oligos) i sammansatta produkter. Eftersom gRNAs är endast ~ 20 nt lång och nya mål kan göras med syntetiserade oligonukleotider, dessa DNA monteringsmetoder är väl lämpade för crispr kloning. De protokoll som beskrivs här bygger på P201 serien crispr vektorer som har använts med framgång i soja 10, poppel 12 och nu tomat. Förfarandet kloning presenteras erbjuder flera fördelar jämfört med den aktuella kloningsmetod 10. Nämligen, kan fullt fungerande vektorer genereras i en enda klonings reaktion på en enda dag. Vektorkonstruktion kan också slås samman för att generera flera crispr vektorer parallellt, vilket ytterligare minskar praktisk tid och materialkostnader. Vi presenterar också ett protokoll för generering av tomat håriga rötter som en effektiv metod för att producera transgena material med riktade gen strykningar. Håriga rötter används för att giltigtåt de crispr vektorerna och ge underlag för efterföljande experiment.
Since DNA assembly is used to recombine any overlapping DNA sequences, this cloning method can be applied to any CRISPR vector construction. Most CRISPR cloning schemes use either gene synthesis of the gRNA, type IIS restriction enzymes17,18, or overlap-extension PCR19. Each of these techniques has inherent advantages and disadvantages, but they typically require multiple hands-on cloning steps. The primary advantage of the cloning method presented here is that the entire process occurs in a single,…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds av National Science Foundation IOS-1025642 (GBM). Vi tackar Maria Harrison för att tillhandahålla ARqua1 stammen.
NEBuilder® (HiFi DNA assembly mix) | New England Biolabs | E5520 | |
p201N:Cas9 | Addgene | 59175 | The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes. |
pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
SwaI | New England Biolabs | R0604S | |
SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
Zymo clean and concentrator-5 column purification | Zymo Research | D4003 | |
NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
NEB CutSmart (Buffer 4) | New England Biolabs | B7204S | |
NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep) | Epoch Life Sciences | 1910-050/250 | |
EcoRV-HF® | New England Biolabs | R3195S | |
StyI-HF® | New England Biolabs | R3500S | |
MS Salts + Gamborg Vitamins | Phytotechnology Laboratories | M404 | |
Phytagel™ (gellan gum) | Sigma Aldrich | P8169 | |
GA-7 Boxes | Sigma Aldrich | V8505 | |
Micropore™ surgical tape | 3M | 1535-0 | |
Timentin® (Ticarcillin/Clavulanic acid) | Various | 0029-6571-26 | |
Primers 5' -> 3' | |||
SwaI_MtU6F | GATATTAATCTCTTCGATGAAATTTATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTGAAG | ||
ScaffoldF | GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT | ||
SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTCAAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
StUbi3P218R | ACATGCACCTAATTTCACTAGATGT | ||
ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTATCCCTAG | Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid | |
UNS1_Scaffold R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCATGCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
p201R | CGCGCCGAATTCTAGTGATCG | ||
Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9. |