Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.
Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.
Leukocyter som fastnat på kapillärerna i lungorna (dvs, marginating-pulmonell (MP) leukocyter) 1 visades att uppvisa distinkta leukocyt komposition och unik aktivitet jämfört med leukocyter från andra immun fack (t.ex., cirkulation, mjälte, benmärg) 2- 4. Till exempel, MP-leukocyter uppvisar högre naturliga mördar (NK) -celler cytotoxicitet mot olika tumörceller, jämfört med cirkulerande och mjält-NK-celler, såväl som differentierade budbärar-RNA (mRNA) -nivåer och ökad utsöndring av pro- och anti-inflammatoriska cytokiner. Sammansättningen av celler är också differentierad från cirkulerande leukocyter som MP-leukocyter har ett högre förhållande mellan medfödda / adaptiv immunitet jämfört med cirkulerande leukocyter (50% vs. 30%, respektive). Målet med den metod som presenteras här är att möjliggöra selektiv skörd av MP-leukocyter, för att studera denna viktiga och unika immun fack (cellpopulation), och att elucIDATE effekterna av olika manipulationer (t.ex. immunaktivering) på dessa specifika celler.
För att förstå betydelsen av denna unika befolkning, är det viktigt att notera att immunsystemet kan styra cirkulerande tumörceller, mikrometastaser och kvarvarande sjukdom genom in vivo-funktioner cellmedierad immunitet (CMI). Denna förmåga är uppenbart trots prejudikat fel i immunsystemet för att styra den primära tumören, och med stöd av riklig in vivo bevis hos cancerpatienter och djurmodeller 5. Viktigt är dessa resultat är ofta oförenliga med in vitro och ex vivo studier, som rapporterar att de flesta autologa tumörceller är resistenta mot cytotoxicitet genom cirkulerande leukocyter i blodprov från människor och djur (mätt med cytotoxicitetsanalyser) 6,7. Denna diskrepans kan tillskrivas förekomsten av olika leukocytpopulationer, såsom ovan in vivoovannämnda MP leukocytpopulationen, och särskilt dess subpopulation av aktiverade NK-celler 3. Faktum är syngena tumörceller (MADB106), som befanns vara resistenta mot cirkulerande och mjälten leukocyter, visade sig lyseras av MP-NK-celler 3,8. Således är de påstått "NK-resistenta" MADB106 celler som metastasera till lungorna hos fischer344 (F344) råttor kontrolleras av MP-NK-celler, men inte genom att cirkulera eller mjälte NK-celler, som vanligtvis studeras med tanke på deras lättillgänglighet.
Renade och aktiva MP-leukocyter är otillgängliga genom de standardskördemetoder av leukocyter från lungorna, som är baserade på lungvävnad slipning eller biologisk nedbrytning 9. Vår strategi har två stora fördelar jämfört med vävnadsbearbetningsmetoder. För det första perfusion metod skördar selektivt MP-leukocyter, som skiljer dem från andra celler som härrör från lunga parenkymala, interstitiell och bronko-alveolär jämtments. För det andra, perfusion tekniken bättre bevarar integriteten och den fysiologiska miljön i MP-leukocyter, till skillnad från slipning och biologisk bearbetning närmar sig skadar celler, förändrar deras morfologi och inducera produktion och frisättning av olika faktorer som modulerar immunaktivitet och specifikt undertrycker NK cytotoxicitet 10.
Lungorna är en stor målorgan för cancermetastaser och för olika infektionssjukdomar. Alla cirkulerande maligna celler och infekterade celler passera genom lungkapillärerna, där de behöver för att deformera och interagera med kapillära endotelceller och bosatta leukocyter. Under dessa förhållanden kan cirkulerande celler lätt måltavla bosatta MP-leukocyter. Det verkar således biologiskt fördelaktigt att ha aktiverade leukocyter i detta immun fack, och det är viktigt att studera denna unika MP-befolkningen i olika biologiska, experimentella och kliniska inställningar. Det är värt att notera att systemic immunaktivering genom olika biologiska-svar-modifierare (t.ex. polyinosinic-polycytidylsyra (poly-I: C) eller typ-C CpG oligodeoxinukleotider (CpG-C ODN)) har visats aktivera MP-leukocyter mer än cirkulerande leukocyter 3, 8,11.
Den metod som presenteras häri möjliggör en selektiv skörd och studera av den unika population av MP-leukocyter. Jämfört med cirkulerande eller mjälten leukocyter, är MP befolkningen kännetecknas av en distinkt sammansättning leukocyt subpopulationer, högre aktiverings högre frisättning av olika cytokiner, och högre mRNA-nivåer av pro- och antiinflammatoriska cytokiner 2,3. Specifikt har vi visat att MP-NK-celler är mer cytotoxiskt än cirkulations NK-celler mot olika målceller 3,4…
The authors have nothing to disclose.
Författarna och detta arbete stöddes av NIH / NCI bidraget # R01CA172138 (till SBE).
Autoclud Peristaltic pump | |||
Butterfly needle | OMG | 26G | |
Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
Syringe | Pic solution | 1 ml | |
Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
Syringe | Pic solution | 5 ml | |
Syringe | Pic solution | 10 ml | |
Syringe | Pic solution | 25 ml | |
Blunted-edged forceps | |||
Scissors | |||
hemostat | |||
Tissue forceps | |||
Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |