JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Neuroscience

Receptor Autoradiografi Protokol til Lokaliseret Visualisering af angiotensin II-receptorer

Published: June 07, 2016
doi:
10.3791/53866
, , ,
1Farquhar College of Arts and Sciences,Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Nova Southeastern University, 3School of Medicine,University of Colorado

Summary

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Abstract

Denne protokol beskriver receptorbindende mønstre for angiotensin II (Ang II) i rottehjerne under anvendelse af en radioligand specifikt for Ang II-receptorer til at udføre receptor autoradiografisk kortlægning.

Vævsprøver høstes og opbevares ved -80 ° C. En kryostat anvendes til coronalt sektion vævet (hjernen) og tø-mount afsnittene på ladede objektglas. Slide-monterede vævssnit inkuberes i 125I-SI-Ang II til radiomærke Ang II-receptorer. Tilstødende objektglas er adskilt i to sæt: "ikke-specifik binding" (NSP) i nærvær af en receptor mættende koncentration af ikke-radiomærket Ang II eller en AT 1 Ang II-receptor subtype (AT 1R) selektiv Ang II-receptorantagonist og 'TOTAL bindende' uden AT 1 R antagonist. En mættende koncentration af AT 2 Ang II-receptor subtype (AT 2R) antagonist (PD123319, 10 uM) er også til stede i incubatipå buffer at begrænse 125I-SI-Ang II-binding til AT 1 R subtype. Under en 30 min før inkubation ved ~ 22 ° C, er NSP slides udsat for 10 uM PD123319 og losartan, mens "total binding" slides er udsat for 10 uM PD123319. Slides inkuberes derefter med 125I-SI-Ang II i overværelse af PD123319 for "alt bindende«, og PD123319 og losartan for NSP i assaypuffer, efterfulgt af flere 'vasker' i buffer, og vand for at fjerne salt og ikke- specifikt bundet radioligand. Objektglassene tørres ved hjælp slag-tørretumblere, derefter udsat for autoradiografi film ved hjælp af en specialiseret film og kassette. Filmen fremkaldes og billederne scannet ind i en computer til visuel og kvantitativ densitometri under anvendelse af en navnebeskyttet billedbehandlingssystem og et regneark. En ekstra sæt dias thionin-farvet for histologiske sammenligninger.

Fordelen ved at anvende receptor autoradiografi er evnen til at visualisereAng II-receptorer in situ, inden for en sektion af en vævsprøve, og anatomisk identificere det område af væv ved at sammenligne den med en tilstødende histologisk henvisning sektion.

Introduction

Hjerte-kar-sygdom fortsætter med at være den førende årsag til død og invaliditet i USA, der forårsager mere end 30% af alle dødsfald i USA i 2011 1. De seneste statistikker fra American Heart Association viser, at mere end én person i tre har en eller flere typer for hjerte-kar-sygdom. Hjerte-kar-forskning fortsætter med at gøre fremskridt mod at forstå denne sygdom, men som generationer begynder at blive ældre er det bydende nødvendigt at fortsætte disse bestræbelser. Renin-angiotensin-systemet (RAS) spiller en central rolle i reguleringen af det cardiovaskulære system primært ved at fremme aterosklerose, betændelse, systemisk vasokonstriktion, og aktivering af det sympatiske nervesystem (figur 1) 2-8.

RAS er et hormonale system, der aktiveres, når juxtaglomerulære celler i nyren udskille renin i blodstrømmen som reaktion på nedsat blodtryk, øget sympathetic stimulering eller nedsat natrium strømning af macula densa. Renin metabolizes angiotensinogen (syntetiseret i leveren) for at danne angiotensin I (Ang I). Ang I derefter metaboliseres af angiotensin-omdannende enzym (ACE), en ectoenzyme på den luminale side af vaskulære endotelceller, primært i lunger og nyrer, til dannelse angiotensin II (Ang II), den vigtigste effektor peptidet RAS. Ang II er stand til at aktivere to receptorundertyper; type 1 receptor (AT 1 R) og type 2-receptor (AT 2R), begge som regulerer det kardiovaskulære system, vedligeholde væske- og elektrolytbalancen homeostase og er nu anses for at påvirke den kognitive funktion og neurodegenerativ sygdom processer 8,9. En lokal, hjerne-specifikke RAS er rapporteret til selvstændigt syntetisere Ang II. I hjernen er precursorproteinet angiotensinogen syntetiseret i astroglia 10 omdannet til angiotensin I ved en renin-lignende enzym 3, muligvis prorenin bundet til prorenin receptoren11, og efterfølgende omdannes til Ang II ved angiotensin-konverterende enzym, som rigeligt udtrykt på den ekstracellulære overflade af neuroner i hjernen 12. Denne intrabrain genereret Ang II er agonist til hjernen AT 1 og AT 2-receptorer, som er isoleret fra blod-bårne Ang II.

Mens AT 1 R spiller en vigtig fysiologisk rolle, er det bedre kendt for sine patofysiologiske virkninger i hele kroppen, primært påvirker det kardiovaskulære system og nyrerne (figur 2). Når Ang II binder til AT 1 R, det forårsager vasokonstriktion; stigende modstand mod blodgennemstrømning og hæve blodtrykket. Det fremmer også syntesen og sekretionen af ​​aldosteron og vasopressin, hvilket fører til øget natrium og væskeophobning. Disse effekter kan også inducere iskæmisk hjerneskade og kognitive svækkelser og er knyttet til Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom, og diabeTES, samt at være for nylig identificeret til at påvirke indlæring og hukommelse 13-15. Der er en tilbagekoblingssløjfe i RAS ved, at 1 R på de juxtaglomerulære celler i nyren hæmmer renin sekretion. Interessant, AT 2 R generelt mod regulerer virkningen af AT 1 R, der forårsager vasodilatation, neuritudvækst, axonal regenerering, anti-spredning, og cerebroprotection blandt mange andre 16-20. AT 2R er også blevet identificeret som et mål for anti-hypertension og for nylig, anticancerlægemidler 21. Bestemmelse af lokaliseringen og tætheden af ​​Ang II-receptorer i forskellige væv, og hvordan de er påvirket af forskellige behandlinger og sygdomstilstande der anvender kvantitativ densitometrisk receptor autoradiografi vil bidrage til at belyse den rolle RAS spiller i specifikke sygdomme.

Receptor-autoradiografi har været anvendt i over 30 år som en effektiv metode til at indikere tilstedeværelsen af ​​angiotensin IJeg receptorer og andre dele af anlægget RAS i hjernen og andre væv i rotter, mus, marsvin, hund og menneske under forskellige forsøgsbetingelser 22-34. Vigtigheden af at lokalisere Ang II-receptorer i hjernen er, at man kan anvende funktionelle neuroanatomi for virkningerne af Ang II i hjernen, fx tilstedeværelsen af AT 1 R i paraventrikulære kerne i hypothalamus (PVN) antyder en funktion af Ang II i hjernen til at stimulere vasopressin, oxytocin eller corticotropin-frigørende hormon (CRH) frigivelse eller aktivering af det sympatiske nervesystem. Således kan lægemidler, der blokerer AT 1 R mindske nogle af disse PVN-medierede virkninger forbundet med overaktivitet af hjernen RAS. Igangværende arbejder tyder på, at brugen af AT 1 R-antagonister kan nedsætte Post-traumatisk stress syndrom (PTSD) induceret frigivelse af CRH og lindre symptomerne på PTSD (Hurt et al., Indsendt til publikation). Den PVN, subfornikaleorgan (SFO), og amygdala er kendt for at regulere homeostase, appetit / tørst, søvn, hukommelse, følelsesmæssige reaktioner, og er målområderne for denne demonstration undersøgelse. Disse regioner blev undersøgt ved at indsamle koronale sektioner af en hjerne på objektglas, og behandling af de sektioner med specifikke hæmmere sammen med en specifik radioaktiv for Ang II-receptorer. I denne undersøgelse alle materialer og reagenser sammen med foreslåede leverandører er anført, iod-125 blev anvendt til at radiomærke et Ang II-receptorantagonist, sarcosin 1, isoleucin 8 Ang II (SI Ang II), som derefter blev oprenset som mono 125I -Si Ang II ved hjælp HPLC-metoder som tidligere 35 beskrevet. Brugen af ​​denne høj specifik aktivitet radioligand tillader visualisering af områder med lav, moderat og høj receptordensitet efter eksponering af de radioaktivt mærkede sektioner til røntgenfilm. Ved at kalibrere filmen med hjernen pasta standarder indeholder kendte mængder af jod-125, det specifikke beløbaf Ang II receptorbinding i et område kan kvantificeres. I eksperimentelle studier kan Ang II receptorbinding i hjernerne hos forsøgspersoner sammenlignes med i hjernerne hos kontrolindivider. Dette kan indikere, om handlinger Ang II ændres som reaktion på en genetisk tilstand, fænotypisk abnormitet, sygdomstilstand eller lægemiddelbehandling. Denne viden kan derefter anvendes til udvikling af terapier til behandling af sygdomme forbundet med dysregulering af RAS. Alternative teknikker, der identificerer receptor bindingssteder, men med reduceret anatomisk opløsning, er bindingsassays, der anvender væv membranpræparater afledt af vævshomogenater, som er inkuberet med radioliganden over et område af koncentrationer for at vurdere radioligandbinding affinitet som dissociationskonstanten (K D ) og maksimal bindingskapacitet (Bmax) i vævet af interesse.

Den her beskrevne protokol kan opdeles i fem større samarbejdemponents: Forberedelse vævssnit for receptor Autoradiografi; Receptor Autoradiografi; Film Eksponering og udvikling; Histologi; og Densitometrisk Image Analysis.

Protocol

Alle dyreforsøg udført for denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Nova Southeastern University i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, 8. udgave (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ). 1. Forberedelse vævssnit for Receptor Autoradiografi Ved offer, høst frisk hjernevæv, og pak i alufolie og sted i en -20 ° C fryser så hurtigt som muligt. For at opretholde den korrekte form, placere hjerner i e…

Representative Results

Oversigten over den metaboliske vej af renin-angiotensin-systemet er vist i figur 1 og den direkte fokus på Angiotensin II receptor-undertyper (AT 1 R og AT 2R) er beskrevet i figur 2. Figur 3 viser overførslen af koronale hjerne sektioner onto mikroskopobjektglas, som derefter køres gennem en receptor autoradiografi under anvendelse af en forudbestemt 125I-Siang II-koncentrationen som det ses i <stron…

Discussion

Protokollen beskrevet identificerer visualisering af 'total' og "ikke-specifik" binding af radioliganden i tilstødende sektioner af koronale sektioner af en hjerne gnaver tidligere høstet og opbevaret ved -80 ° C, og kan nemt anvendes på stort set alle væv, har anatomisk løst underlag, som viser differentierede mængder af receptorer eller radioligandbinding sites. De beskrevne inden protokollen er enkle og analysen er kritisk for korrekt fortolkning af resultater. Tykkelsen 20 um blev bestemt ti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH Grant HL-113905

Materials

500ml Plastic Beakers Fisher 02-591-30
24mm x 60mm Coverslips Fisher 22-050-25
Autoradiography Imaging Film 24x30cm Carestream-Biomax MR Film 891-2560
Bacitracin (from Bacillus licheniformis) Sigma B-0125
Cardboard Sheet 8×11 Crescent Illustration Board #201 201
Coplin Jars Fisher Scientific E94
Commercial hair dryers Conair Model SD6X
Disposable Culture Tubes Fisher 14-961-26
EDTA (Disodium salt, Dihydrate) USB Corporation 15-699
Ethanol Fisher 16-100-210 
Formulary Substitute for D-19 Developer Photographers Formulary, Inc.  01-0036
Glacial Acetic Acid Fisher A38 SI-212
Histoprep / OCT Fisher SH75-125D
Film Fixer Kodak 5160320
Photo flo Kodak 1464502
Losartan Fisher/Tocris 37-985-0
MCID™ Core 7.0 MCID N/A
NaCl Fisher S271
Peel-A-Way slide grips VWR 48440-003
Permount Fisher SP15-100
PD123319 Fisher 13-615-0
Premium Charged Slides , Fine Ground Edge Premiere Microscope Slides 9308W
125I Ligands Perkin Elmer NEX- 248
125SI-Ang II  George Washington University Radioiodinated by Dr. Speth
Slide Mailers Fisher Scientific HS15986
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) Fisher RDCS0750500
Sodium Acetate (Anhydrous) Fisher BP333-500
Thionin  Fisher T409-25
X-Ray Casette (10 x 12) Spectronics Corporation Four Square
Xylene Fisher  X3P-1GAL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
  2. Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
  3. Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
  4. Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U., Ganong, W. F., Martini, L. . Frontiers in Neuroendocrinology. , 61-99 (1978).
  5. Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, 19-24 (1995).
  6. von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
  7. Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004 (2013).
  8. de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
  9. Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
  10. Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
  11. Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
  12. Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
  13. Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
  14. Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
  15. Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
  16. Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
  17. Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
  18. Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
  19. Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
  20. Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
  21. Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
  22. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
  23. Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
  24. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
  25. Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
  26. Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
  27. Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
  28. Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
  29. Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
  30. Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
  31. Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
  32. MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
  33. Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
  34. Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
  35. Speth, R. C., Harding, J. W., Wang, D. H. . Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. , 275-295 (2001).
  36. Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
  37. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
  38. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
  39. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
  40. Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
  41. Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
  42. Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
  43. Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
  44. Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
  45. Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
  46. Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
  47. Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
  48. Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
  49. Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
  50. Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).

Tags

Receptor AutoradiographyAngiotensin II ReceptorsBrain SectionsQuantificationLocalizationNeurodegenerative DiseasesCardiovascular DiseasesHormone Receptor SystemsDrugs Of AbuseCryostat SectioningMicroscope SlidesRadio LabelingNon-specific TreatmentTotal Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Linares, A., Couling, L. E., Carrera, E. J., Speth, R. C. Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors. J. Vis. Exp. (112), e53866, doi:10.3791/53866 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image