Receptor Autoradiografi Protokoll for Lokalisert Visualisering av angiotensin II-reseptorer

Summary

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Abstract

Denne protokollen beskriver reseptor bindende mønstre for Angiotensin II (Ang II) i rottehjernen ved hjelp av en radioligand bestemt for Ang II-reseptorer for å utføre reseptor autoradiografisk kartlegging.

Vevsprøver er høstet og lagret ved -80 ° C. En Kryostaten brukes til coronally seksjon vev (hjerne) og tine-mount seksjonene på ladede lysbilder. Glidemontert vevssnitt inkuberes i ¹²⁵ I-SI-Ang II å radio Ang II-reseptorer. Tilstøtende lysbilder er delt opp i to sett: 'ikke-spesifikk binding "(NSP), i nærvær av en reseptor mette konsentrasjon av ikke-radiomerket Ang II, eller en _AT-1 Ang II reseptor-undertype (AT ₁ R) selektiv Ang II reseptor-antagonist og "total binding 'uten AT _en R antagonist. En metningskonsentrasjon på ₂ Ang II reseptor-undertype (AT _2R) antagonist (PD123319, 10 pM) er også til stede i den incubatipå buffer for å begrense ¹²⁵ I-SI-Ang II binding til AT ₁ R subtype. I løpet av en 30 minutters preinkubering ved ~ 22 ° C, blir NSP lysbilder eksponert for 10 uM PD123319 og losartan, mens "total binding" lysbilder er utsatt for 10 uM PD123319. Objektglassene ble deretter inkubert med ¹²⁵ I-SI-Ang II i nærvær av PD123319 for "total binding", og PD123319 og losartan for NSP i analysebuffer, etterfulgt av flere vaskinger '' i buffer, og vann for å fjerne salt og ikke- spesifikt bundet radioligand. Skinnene er tørket bruker blow-tørketrommel, deretter utsatt for autoradiografi film ved hjelp av en spesialisert film og kassett. Filmen er utviklet og bildene er skannet inn i en datamaskin for visuell og kvantitativ densitometry bruker en proprietær imaging system og et regneark. Et ekstra sett med lysbilder er thionin-farget for histologiske sammenligninger.

Fordelen med å bruke reseptor autoradiografi er evnen til å visualisereAng II-reseptorer in situ, i et utsnitt av en vevsprøve, og anatomisk identifiserer det område av vev ved å sammenligne det med en tilstøtende histologiske referansedelen.

Introduction

Hjerte- og karsykdommer fortsetter å være den ledende årsak til død og uførhet i USA, forårsaker mer enn 30% av dødsfall i USA i 2011 ^en. De siste statistikk fra American Heart Association viser at mer enn én person i tre har en eller mer type kardiovaskulær sykdom. Cardiovascular forskning fortsetter å gjøre fremskritt mot å forstå denne sykdommen, men som generasjoner begynner å bli eldre er det viktig å fortsette dette arbeidet. Renin-angiotensin-systemet (RAS) spiller en sentral rolle i regulering av det kardiovaskulære systemet først og fremst ved å fremme aterosklerose, inflammasjon, systemisk vasokonstriksjon, og aktivering av det sympatiske nervesystemet (figur 1) ^2-8.

RAS er en hormonell system som aktiveres når juxtaglomerulære celler i nyrene utskiller renin i blodstrømmen som reaksjon på redusert blodtrykk, øket sympathetic stimulering, eller redusert natrium flyt av makula densa. Renin metaboliserer angiotensinogen (syntetisert i leveren) for å danne angiotensin I (Ang I). Ang I blir deretter metabolisert av angiotensin-konverterende enzym (ACE), en ectoenzyme på den luminale siden av vaskulære endotelceller, først og fremst i lunger og nyrer, for å danne angiotensin II (Ang II), den viktigste effektor peptidet av RAS. Ang II er i stand til å aktivere to reseptor-subtyper; type 1 reseptor (AT ₁ R) og type 2-reseptoren (AT ₂ R), både som regulerer det kardiovaskulære systemet, opprettholde væske- og elektrolytt homeostase og er nå ansett å påvirke kognitiv funksjon og nevrodegenerativ sykdom prosesser ^8,9. En lokal, hjerne-spesifikk RAS er rapportert til selvstendig syntetisere Ang II. I hjernen, er det forløperproteinet angiotensinogen syntetisert astroglia ¹⁰ omdannet til Ang I ved en renin-enzym ^3, eventuelt prorenin bundet til reseptoren prorenin^11, og deretter omdannes til Ang II ved angiotensin-konverterende enzym som er rikelig uttrykt på den ekstracellulære overflaten av neuroner i hjernen ^12. Dette intrabrain genererte Ang II er en agonist for hjernen AT ₁ og _{AT-2-reseptorer} som er isolert fra blod-båret Ang II.

Mens AT _en R spiller en viktig fysiologisk rolle, er det bedre kjent for sine patofysiologiske effekter i hele kroppen, først og fremst påvirker det kardiovaskulære systemet og nyrer (figur 2). Når Ang II bindes til AT ₁ R, fører det til vasokonstriksjon; økende motstand mot blodstrømmen og å øke blodtrykket. Det fremmer også syntese og sekresjon av aldosteron og vasopressin, som fører til øket natrium- og vannretensjon. Disse effektene kan også forårsake iskemisk hjerneskade og kognitiv svikt og er knyttet til Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, og Diabetes Tates, så vel som å være nylig identifisert til å påvirke læring og hukommelse ^13-15. Det er en tilbakekoblingssløyfe i den RAS ved at i _en R på juxtaglomerulære celler i nyrene hemmer renin sekresjon. Interessant, AT ₂ R generelt kontra regulerer virkningen av AT ₁ R, forårsaker vasodilatasjon, neurittutvekst, aksonal regenerasjon, anti-spredning, og cerebroprotection blant mange andre ^16-20. AT ₂ R har også blitt identifisert som et mål for anti-hypertensjon og nylig, anti-kreft narkotika ^21. Fastsettelse av lokalisering og tetthet av Ang II-reseptorer i ulike vev og hvordan de påvirkes av forskjellige behandlinger og sykdomstilstander ved hjelp av kvantitativ densitometrisk reseptor autoradiografi vil bidra til å avdekke hvilken rolle RAS spiller i spesifikke sykdommer.

Receptor autoradiografi har vært brukt i over 30 år som en effektiv metode for å indikere tilstedeværelsen av angiotensin II reseptorer og andre komponenter av RAS i hjernen og andre vev fra rotte, mus, marsvin, hund og menneske under forskjellige eksperimentelle betingelser ^22-34. Betydningen av å lokalisere Ang II-reseptorer i hjernen er at man kan anvende funksjonelle neuroanatomy av handlingene til Ang II i hjernen, for eksempel nærvær av _en R i den paraventrikulære kjerne av hypothalamus (PVN) foreslår en funksjon av Ang II i hjernen for å stimulere vasopressin, oksytocin eller kortikotropin-frigjørende hormon (CRH) frigivelse, eller aktivering av det sympatiske nervesystemet. Således kan medikamenter som blokkerer den _AT-1 R redusere noen av disse PVN-medierte effekter forbundet med overaktivitet av hjernen RAS. Varer i arbeid antyder at bruk av AT ₁ R-antagonister kan redusere Post-traumatisk stresslidelse (PTSD) -indusert frigjøring av CRH og bedre symptomene på PTSD (Hurt et al., Innsendt for publisering). Den PVN, subfornicalorgan (SFO), og amygdala er kjent for å regulere homeostase, appetitt / tørst, søvn, hukommelse, følelsesmessige reaksjoner, og er målområdene i denne demonstrasjonen studien. Disse områdene ble undersøkt ved å samle koronale deler av en hjerne på objektglass, og behandle de deler med spesifikke hemmere sammen med en bestemt radioligand for Ang II-reseptorer. I denne studien ble alle materialer og reagenser sammen med foreslåtte leverandører er oppført, jod-125 ble anvendt for å radiomerke en Ang II reseptor antagonist, sarkosin ^1, isoleucin ⁸ Ang II (SI Ang II), som så ble renset som mono ^125I -Si Ang II ved hjelp av HPLC-metoder som beskrevet tidligere ^35. Anvendelsen av denne høye spesifikk aktivitet radioligand tillater visualisering av områder med lav, middels og høy tetthet reseptoren etter eksponering av de radiomerkede seksjonene til røntgenfilm. Ved kalibrering av filmen med hjerne lim-standarder inneholdende kjente mengder av jod-125, bestemt beløpav Ang II reseptor binding i et område kan kvantifiseres. I eksperimentelle studier, kan den Ang II reseptor binding i hjernen til eksperimentelle fag sammenlignes med at i hjernen til kontrollpersoner. Dette kan indikere hvorvidt handlingene til Ang II er endret som reaksjon på en genetisk sykdom, fenotypisk abnormitet, sykdomstilstand eller medikamentell behandling. Denne kunnskapen kan deretter brukes til utvikling av terapi for behandling av sykdommer forbundet med dysregulering av RAS. Alternative teknikker som identifiserer reseptor-bindingsseter, men med redusert anatomisk oppløsning, blir bindingsanalyser som bruker vevet membranpreparater avledet fra vevshomogenater, som er inkubert med radioliganden over et område av konsentrasjoner for å vurdere radioligand bindingsaffiniteten som dissosiasjonskonstanten (K _D ) og maksimal bindingskapasitet (B _maks) i vevet av interesse.

Protokollen er beskrevet her kan bli brutt ned i fem store components: Forberede vevssnitt for Receptor Autoradiografi; Receptor Autoradiografi; Film Eksponering og utvikling; histologi; og Densitometrisk bildeanalyse.

Protocol

Alle dyr prosedyrer utført i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Nova Southeastern University i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, 8. utgave (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ). 1. Klar vevssnitt for Receptor Autoradiografi Ved ofring, slakte friske hjernevevet, og pakk inn i aluminiumsfolie og legg i en -20 ° C fryser så snart som mulig. For å opprettholde riktig form, legg hjernen i en hjerne mold som simulerer in…

Representative Results

Oversikten over den metabolske veien til renin-angiotensin-systemet er vist i figur 1 og den direkte fokus på angiotensin-II-reseptor-subtyper (AT 1 R og AT 2R) er beskrevet i figur 2. Figur 3 viser overføringen av koronale hjerne seksjoner bort på objektglass, som deretter kjøres gjennom en reseptor autoradiografi prosedyre ved bruk av et forhåndsbestemt 125 i-Siang ll-konsentrasjonen som vist i <st…

Discussion

Protokollen er beskrevet identifiserer visualiseringen av "total" og "ikke-spesifikk" binding av radioliganden i tilstøtende seksjoner av koronale seksjoner av en gnagerhjerne tidligere høstet og lagret ved -80 ° C, og kan lett anvendes på praktisk talt alle vev som har anatomisk løst understell som viser differensial mengder av reseptorer eller radioligandbindingsstudier bindingssteder. De prosedyrer som er beskrevet i protokollen er enkle og analysen er kritisk for korrekt tolking av resultate…

Materials

500ml Plastic Beakers	Fisher	02-591-30
24mm x 60mm Coverslips	Fisher	22-050-25
Autoradiography Imaging Film 24x30cm	Carestream-Biomax MR Film	891-2560
Bacitracin (from Bacillus licheniformis)	Sigma	B-0125
Cardboard Sheet 8×11	Crescent Illustration Board #201	201
Coplin Jars	Fisher Scientific	E94
Commercial hair dryers	Conair	Model SD6X
Disposable Culture Tubes	Fisher	14-961-26
EDTA (Disodium salt, Dihydrate)	USB Corporation	15-699
Ethanol	Fisher	16-100-210
Formulary Substitute for D-19 Developer	Photographers Formulary, Inc.	01-0036
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38 SI-212
Histoprep / OCT	Fisher	SH75-125D
Film Fixer	Kodak	5160320
Photo flo	Kodak	1464502
Losartan	Fisher/Tocris	37-985-0
MCID™ Core 7.0	MCID	N/A
NaCl	Fisher	S271
Peel-A-Way slide grips	VWR	48440-003
Permount	Fisher	SP15-100
PD123319	Fisher	13-615-0
Premium Charged Slides , Fine Ground Edge	Premiere Microscope Slides	9308W
125I Ligands	Perkin Elmer	NEX- 248
125SI-Ang II	George Washington University	Radioiodinated by Dr. Speth
Slide Mailers	Fisher Scientific	HS15986
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4)	Fisher	RDCS0750500
Sodium Acetate (Anhydrous)	Fisher	BP333-500
Thionin	Fisher	T409-25
X-Ray Casette (10 x 12)	Spectronics Corporation	Four Square
Xylene	Fisher	X3P-1GAL