Receptor Autoradiografi protokollet om Lokaliserad Visualisering av angiotensin II-receptorer
Summary
Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.
Abstract
Detta protokoll beskriver receptorbindnings mönster för angiotensin II (Ang II) i råtthjärna med hjälp av en radioligand specifik för Ang Il-receptorer för att utföra receptorautoradiografisk kartläggning.
Vävnadsprov skördas och lagras vid -80 ° C. En kryostat används för att koronalt avsnitt vävnaden (hjärnan) och tina-montera sektionerna på laddade objektglas. Glidmonterade vävnadssnitt inkuberas i 125 I-SI-Ang II för radioaktiv märkning av Ang II-receptorer. Intilliggande diabilder är separerade i två uppsättningar: "icke-specifik bindning" (NSP) i närvaro av en receptormättande koncentration av icke-radiomärkt Ang II, eller en AT 1 Ang II receptorsubtypen (AT 1 R) selektiv Ang II receptorantagonist och "total bindning" utan AT 1R antagonist. En mättande koncentration av AT 2 Ang II receptorsubtypen (AT 2 R) antagonist (PD123319, 10 ^ M) är också närvarande i incubatipå buffert att begränsa 125I-SI-Ang II bindning till AT 1 R subtyp. Under en 30 min förinkubation vid ~ 22 ° C, NSP glasen exponeras för 10 iM PD123319 och losartan, medan "total bindning" diabilder utsätts för 10 iM PD123319. Diabilder inkuberas sedan med 125 I-SI-Ang II i närvaro av PD123319 för "total bindning", och PD123319 och losartan för NSP i analysbuffert, följt av flera "tvättar" i buffert, och vatten för att avlägsna salt och icke- specifikt bunden radioligand. Det får torka med användning av blow-torkar, därefter utsätts för autoradiografifilm under användning av en specialiserad film och kassett. Filmen utvecklas och bilderna har skannats in i en dator för visuell och kvantitativ densitometri med hjälp av en egenutvecklad bildsystem och ett kalkylprogram. En extra uppsättning av objektglas tionin-färgas för histologiska jämförelser.
Fördelen med att använda receptorautoradiografi är förmågan att visualiseraAng Il-receptorer in situ, inom en sektion av ett vävnadsprov, och anatomiskt identifiera regionen av vävnaden genom att jämföra den med en intilliggande histologisk referenssektion.
Introduction
Hjärt-kärlsjukdom är fortfarande den vanligaste dödsorsaken och funktionshinder i USA, vilket leder till mer än 30% av dödsfallen i USA under 2011 en. Den senaste statistiken från American Heart Association visar att mer än en person i tre har en eller flera typer av hjärt-kärlsjukdom. Kardiovaskulär forskning fortsätter att göra framsteg mot att förstå denna sjukdom, men som generationer börjar bli äldre är det nödvändigt att fortsätta dessa ansträngningar. Renin-angiotensin-systemet (RAS) spelar en central roll i regleringen av det kardiovaskulära systemet i första hand genom att främja ateroskleros, inflammation, systemisk kärlsammandragning, och aktivering av det sympatiska nervsystemet (figur 1) 2-8.
RAS är en hormonsystem som aktiveras när juxtaglomerulära celler i njuren utsöndrar renin i blodet som svar på sänkt blodtryck, ökad sympathetic stimulering eller minskat natrium flöde av macula densa. Renin metaboliserar angiotensinogen (syntetiserad i levern) för att bilda angiotensin I (Ang I). Ang I därefter metaboliseras av angiotensin converting enzyme (ACE), ett ectoenzyme på den luminala sidan av vaskulära endotelceller, främst i lungorna och njurarna, för att bilda angiotensin II (Ang II), den viktigaste effektor peptid med RAS. Ang II är kapabel att aktivera två receptorsubtyper; typ 1-receptorn (AT 1 R) och den typ 2-receptorn (AT 2 R), såväl som reglerar det kardiovaskulära systemet, upprätthålla vätske- och elektrolyt-homeostas och är nu anses påverka kognitiv funktion och neurodegenerativ sjukdomsprocesser 8,9. En lokal, hjärna specifika RAS rapporteras att självständigt syntetisera Ang II. I hjärnan, är prekursorproteinet angiotensinogen syntetiserats i astroglia 10 omvandlas till Ang I genom en renin-liknande enzym 3, möjligen prorenin bunden till prorenin-receptorn11, och därefter omvandlas till Ang II av angiotensin-konverterande enzym, som rikligt uttrycks på den extracellulära ytan av nervceller i hjärnan 12. Denna intrabrain genereras Ang II är agonisten för hjärnan AT 1 och AT 2-receptorer som är isolerade från blodburen Ang II.
Medan AT 1 R spelar en viktig fysiologisk roll, är det bättre känd för sina patofysiologiska effekter i hela kroppen, framförallt påverkar hjärt-kärlsystemet och njurarna (Figur 2). När Ang II binder till AT 1 R, orsakar det vasokonstriktion; ökande motståndet mot blodflödet och höja blodtrycket. Det främjar också syntes och utsöndring av aldosteron och vasopressin, vilket leder till ökad natrium och vätskeretention. Dessa effekter kan också inducera ischemisk hjärnskada och kognitiva försämringar och är kopplad till Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom, och hjärtes, samt är nyligen identifierats att påverka inlärning och minne 13-15. Det finns en återkopplingsslinga i RAS i att AT ett R på de juxtaglomerulära cellerna i njuren hämmar reninutsöndring. Intressant, AT 2 R i allmänhet kontra reglerar verkan av AT 1 R, vilket vasodilatation, neuritutväxt, axonal regenerering, anti-spridning, och cerebroprotection bland många andra 16-20. AT 2 R har också identifierats som ett mål för anti-hypertoni och nyligen, läkemedel mot cancer 21. Fastställande av lokaliseringen och densiteten av Ang II-receptorer inom olika vävnader och hur de påverkas av olika behandlingar och sjukdomstillstånd med hjälp av kvantitativ densitometriska receptorautoradiografi kan avslöja roll RAS spelar i specifika sjukdomar.
Receptorautoradiografi har använts i över 30 år som en effektiv metod för att indikera närvaron av angiotensin II receptorer och andra komponenter i de RAS i hjärnan och andra vävnader i råtta, mus, marsvin, hund och människa under en mängd olika experimentella förhållanden 22-34. Betydelsen av att lokalisera Ang II-receptorer i hjärnan är att man kan tillämpa funktionell neuroanatomi de åtgärder av Ang II i hjärnan, till exempel, föreslår närvaron av AT 1 R i paraventrikulära kärnan av hypotalamus (PVN) en funktion av Ang II i hjärnan för att stimulera vasopressin, oxytocin eller kortikotropinfrisättande hormon (CRH) frisättning, eller aktivering av det sympatiska nervsystemet. Således kan läkemedel som blockerar AT1 R minska en del av dessa PVN-medierade effekter i samband med överaktivitet av hjärn RAS. Pågående arbeten tyder på att användningen av AT 1 R-antagonister kan minska Posttraumatiskt stressyndrom (PTSD) inducerad frisättning av CRH och lindra symptomen av PTSD (Hurt et al., Lämnades för offentliggörande). PVN, subfornicalorgan (SFO), och amygdala är kända för att reglera homeostas, aptit / törst, sömn, minne, emotionella reaktioner, och är målområdena i denna demonstration studie. Dessa regioner undersöktes genom att samla koronalt delar av en hjärna på objektglas, och behandla avsnitt med specifika hämmare tillsammans med en specifik radioligand för Ang II-receptorer. I denna studie, alla material och reagens tillsammans med förslag på leverantörer listas, jod-125 användes för att radiomärka en Ang II-receptorantagonist, sarkosin en, isoleucin 8 Ang II (SI Ang II), som sedan renades som mono 125I Si Ang II med hjälp av HPLC-metoder som beskrivits tidigare 35. Användning av denna hög specifik aktivitet radioligand medger visualisering av områden med låg, måttlig och hög receptortäthet efter exponering av de radioaktivt märkta sektionerna för röntgenfilm. Genom att kalibrera filmen med hjärn klistra standardlösningar som innehåller kända mängder av jod-125, det specifika beloppav Ang II receptorbindning i ett område kan kvantifieras. I experimentella studier kan Ang II receptorbindning i hjärnan hos försökspersoner att jämfört med den i hjärnan hos kontrollindivider. Detta kan indikera om agerande Ang II ändras som svar på en genetisk sjukdom, fenotypisk abnormitet, sjukdomstillstånd eller läkemedelsbehandling. Denna kunskap kan sedan användas till att utveckla behandlingar för att behandla sjukdomar som förknippas med dysreglering av RAS. Alternativa tekniker som identifierar receptorbindningsställen, men med reducerad anatomisk upplösning, är bindningsanalyser som använder vävnadsmembranpreparat härledda från vävnadshomogenat, som inkuberas med radioligand över ett intervall av koncentrationer för att bedöma radioligand bindningsaffinitet som dissociationskonstanten (K D ) och maximal bindningskapacitet (Bmax) av vävnaden av intresse.
Protokollet som beskrivs här kan delas upp i fem större samarbetemponents: Förbereda vävnadssnitt för Receptor Autoradiografi; Receptor Autoradiografi; Film Exponering och utveckling; Histologi; och Densitometrisk bildanalys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som beskrivits identifierar visualisering av "total" och "icke-specifik" bindning av radioliganden i angränsande delar av koronala sektioner av en gnagare hjärna tidigare skördas och förvaras vid -80 ° C, och kan lätt tillämpas på så gott som alla vävnader som har anatomiskt löst strukturer som visar differensbelopp av receptorer eller radioligand bindningsställen. De förfaranden som beskrivs i protokollet är enkla och analysen är avgörande för korrekt tolkning av resul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grant HL-113905
Materials
| 500ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24mm x 60mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24x30cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8×11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep / OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides , Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
- Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
- Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
- Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U., Ganong, W. F., Martini, L. . Frontiers in Neuroendocrinology. , 61-99 (1978).
- Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, 19-24 (1995).
- von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
- Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004 (2013).
- de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
- Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
- Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
- Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
- Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
- Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
- Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
- Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
- Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
- Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
- Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
- Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
- Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
- Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
- Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
- Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
- Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
- Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
- Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
- Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
- Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
- Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
- MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
- Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
- Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
- Speth, R. C., Harding, J. W., Wang, D. H. . Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. , 275-295 (2001).
- Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
- Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
- Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
- Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
- Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
- Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
- Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
- Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
- Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
- Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
- Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
- Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).
