गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) मरीजों के प्लाज्मा में Exosomal miRNA विश्लेषण qPCR के माध्यम से: एक व्यवहार्य लिक्विड बायोप्सी उपकरण
Summary
This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.
Abstract
The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2–ΔΔct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.
Introduction
NSCLC (गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर) के रोगियों में कम जीवित रहने की दर मुख्य रूप से उन्नत रोग और गरीब जल्दी पता लगाने 1 में उपचार के सीमित प्रभावकारिता के कारण है। EGFR जीन म्यूटेशन में सक्रिय हैं, कि NSCLC रोगियों की एक उप-जनसंख्या में खोज की गई है, काइनेज अवरोधकों (TKIs) tyrosine के प्रति संवेदनशीलता प्रदान करने के लिए जाना जाता है। दुर्भाग्य से, EGFR उत्परिवर्तित NSCLC रोगियों के बहुमत TKI प्रतिरोध 2 का विकास। खास तौर पर इस संदर्भ में, एक सही निदान अनिवार्य है। सामान्य, ट्यूमर के स्थानीयकरण, के कारण NSCLC में बायोप्सी ऊतक प्राप्त करने में हमेशा संभव नहीं है। इसलिए, कई अध्ययनों से चल रही है कि गैर-आक्रामक तरीकों का उपयोग इन जैविक डेटा प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं। Exosomes तरल बायोप्सी घटक है कि आदेश गैर इनवेसिव तकनीक 3 के साथ नैदानिक और शकुन मूल्यों को प्राप्त करने के लिए जांच की जा सकता है के रूप में वर्णित हैं।
ई – (100 एनएम व्यास 40) Exosomes nanovesicles हैंndocytic मूल है कि दोनों शारीरिक और रोग की स्थिति 4 में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं द्वारा जारी किया जाता है। वे प्रोटीन, लिपिड, mRNA और microRNAs ले जा सकता है। इसके अलावा, कई अध्ययनों से ट्यूमर निकाली गई exosomes है, जो ट्यूमर कोशिकाओं, angiogenesis, stromal और बाह्य मैट्रिक्स remodeling और दवा प्रतिरोध 5 के विकास और अस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं की एक pleiotropic भूमिका सुझाव देते हैं।
MicroRNAs (miRNAs) लघु गैर-कोडिंग आरएनए कि, बाद ट्रांसक्रिप्शनल नियमन में शामिल कर रहे हैं लक्ष्य mRNAs का 3'-UTR बंधन और क्षरण करने के लिए या एक गैर अनुवाद करने के लिए 6 mRNA अग्रणी रहे हैं। exosomes में miRNAs के चुनिंदा छँटाई वर्णित किया गया है। इस संदर्भ में, हाल ही में इन विट्रो और इन विवो में प्रदर्शन किया गया था, curcumin उपचार के बाद 7 पुरानी माइलोजेनस ल्यूकेमिया सेल लाइनों द्वारा जारी exosomes में मीर -21 (ऑन्कोजेनिक प्रभाव के साथ एक प्रसिद्ध miRNA) के एक चयनात्मक पैकेजिंग।
exosomal miRNA प्रोफ़ाइल प्राथमिक ट्यूमर के miRNA प्रोफ़ाइल के समान है और इस सुविधा शीघ्र निदान और रोग का निदान 3 में शोषण किया जा सकता है। विशेष रूप से, वहाँ चिह्नित करने के लिए, वास्तविक समय पीसीआर द्वारा एक संभावना है, रोग के आणविक प्रोफाइल, साथ सहसंबद्ध चयन किया miRNAs जैसे।, दूसरों के बीच में 8 EGFR म्यूटेशन।
इधर, NSCLC सहसंबद्ध miRNAs 8-9 के एक चयनित पैनल के विश्लेषण में वर्णित है कि NSCLC रोगियों के रक्त में जारी exosomes से अलग थे जाता है। मरीजों से सहमति की रिपोर्ट को सूचित प्राप्त करने के बाद, 12 NSCLC रोगियों और 6 स्वस्थ नियंत्रण के प्लाज्मा, विश्लेषण किया गया। exosome अलगाव निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार वाणिज्यिक किट के साथ प्रदर्शन किया गया था। exosome अलगाव से पहले, प्लाज्मा नमूनों आदेश संदूषक घूम miRNAs नीचा करने में, RNase के साथ इलाज किया गया। हम अन्य तकनीक की सीमित मानकीकरण के कारण एक वाणिज्यिक किट के साथ इस विश्लेषण प्रदर्शन करने का निर्णय लियासवाल (जैसे।, ultracentrifugation), जो विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जब नैदानिक नमूनों के साथ काम कर रहे हैं। इस किट में एक proteinase कश्मीर इलाज है, जो RNAse नीचा दिखाना होगा, और इस तरह जोखिम exosome सेल के बाद exosomal miRNAs नीचा करने के लिए कम हो जाती है। MicroRNA विश्लेषण संवेदनशील और विशिष्ट रियल-टाइम पीसीआर विश्लेषण द्वारा किया गया था; ΔΔct – मीर 1228-3p सूत्र 2 के अनुसार एक अंतर्जात नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था और डेटा सामान्यीकृत थे। नियंत्रण मूल्यों आधार रेखा के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और परिणाम एक लघुगणकीय पैमाने में दिखाया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस संयुक्त प्रोटोकॉल के साथ यह NSCLC रोगियों के प्लाज्मा से एक exosomal miRNA विश्लेषण करने के लिए संभव था। इन आंकड़ों से रोग की स्थिति को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, लेकिन यह आगे के अध्ययन से इस बात की पुष्टि करने की ज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was also financed by MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.
Materials
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
- Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
- Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
- Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
- Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
- Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
- Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR’1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).
