qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı
Summary
This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.
Abstract
The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2–ΔΔct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.
Introduction
KHDAK (küçük hücre dışı akciğer kanseri) hastalarında düşük sağkalım oranı ilerlemiş hastalık ve kötü erken teşhis 1 tedavilerin sınırlı etkinliği kaynaklanmaktadır. NSCLC hasta alt grubunda keşfedilmiştir EGFR gen aktive eden mutasyonu, kinaz inhibitörleri (TKİ) tirozin hassasiyet kazandırdığı bilinmektedir. Ne yazık ki, EGFR mutasyona uğramış KHDAK hastalarının çoğunluğu TKİ direncini 2 gelişir. Özellikle, bu bağlamda, bir doğru tanı zorunludur. nedeniyle tümörlerin lokalizasyonu, için, genel olarak KHDAK biyopsi dokusu elde her zaman mümkün değildir. Bu nedenle, çeşitli çalışmalar bu biyolojik veriler elde etmek non-invaziv yöntemler kullanan devam etmektedir. Eksozomlar non-invaziv tekniklerin 3 ile tanısal ve prognostik değerlerini elde etmek için incelenmiştir olabilir sıvı biyopsi bileşenler olarak tarif edilmiştir.
e – (100 nm çapında 40) eksozomlar nanovesicles vardırFizyolojik ve patolojik koşullar 4 hem de farklı hücre tipleri tarafından yayımlanan ndocytic kökenli. Onlar, protein, lipidler, mRNA ve microRNA taşıyabilir. Ayrıca, çeşitli çalışmalarda tümör hücreleri, anjiyogenez, stromal ve hücre dışı matriks yeniden ve ilaç direncinin 5 büyüme ve hayatta kalma etkileyebilir tümör kaynaklı Eksozomlann, bir pleiotropik rol oynadığını düşündürmektedir.
MikroRNA'lar (miRNA'ların) hedef mRNA 3'-UTR bağlanması ve bozunmaya karşı ya da olmayan bir çeviri 6 mRNA lider, transkripsiyon sonrası düzenleme katılan kısa kodlayıcı olmayan RNA bulunmaktadır. Eksozomlann içine miRNA'ların seçici sıralama tarif edilmiştir. Bu bağlamda, son zamanlarda, in vitro ve in vivo olarak, kurkumin tedavisi 7 sonrası kronik miyelojen lösemi hücre hatları tarafından yayımlanan eksozom Mir-21 (onkogenik etkiler ile iyi bilinen bir miRNA'nın) seçici bir ambalaj gösterilmiştir.
exosomal miRNA profil primer tümörün miRNA profiline benzer ve bu özellik erken tanı ve prognoz 3 yararlanılabilir. Spesifik olarak, gerçek zamanlı PCR ile, karakterize etmek için bir olasılık, hastalığın moleküler profili ile ilişkili seçilen miRNA'lar örn., Diğerlerinin 8 arasında EGFR mutasyonları.
Burada, NSCLC dekorele miRNA'ların 8-9 seçilmiş bir panelin analizi NSCLC hastaların kanında serbest eksozom izole edildi açıklanmaktadır. hastalardan onam raporu bilgilendirmek alındıktan sonra, 12 KHDAK hastalarında ve 6 sağlıklı kontrollerin plazma, analiz edildi. eksozom yalıtım üreticinin protokolüne göre, ticari kiti ile gerçekleştirildi. eksozom izolasyon önce plazma numuneleri kirletici dolaşım miRNA'lar indirgeme amacıyla, RNase ile muamele edilmiştir. Biz nedeniyle diğer Techni sınırlı standardizasyona ticari kit ile bu analizi gerçekleştirmek için kararklinik örneklerden çalışırken özellikle önemlidir ques (örn., Ultrasantrifügasyon). Bu kit RNAse aşağılamak ve böylece exosome Parçalama işleminden sonra exosomal miRNA'lar düşmeye riskini azaltır bir Proteinaz K tedavisi içerir. MikroRNA analizi duyarlı ve spesifik Real-Time PCR analizi ile yapıldı; mir 1228-3p, formül 2'ye uygun bir endojen bir kontrol olarak kullanıldı ve veri normalleştirildi – ΔΔct. Kontrol değerleri temel olarak kullanılır ve Sonuçlar bir logaritmik skalada gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu kombine protokolü sayesinde KHDAK hastalarının plazmadan bir exosomal miRNA analizi gerçekleştirmek mümkün olmuştur. Bu veriler, bir hastalık durumu göstermektedir, ancak bu daha fazla çalışma ile teyit edilmesi gerekmektedir.
Bu yazıda kullanılan protokol, eksozom izolasyonu için ticari bir kit dayanıyordu. Sebebi bilinen diğer izolasyon prosedürleri (örneğin., Yoğunluk gradyan Ultrasantrifügasyon) sınırlı bir standardizasyona lider, daha fazla manuel p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was also financed by MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.
Materials
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
- Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
- Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
- Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
- Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
- Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
- Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR’1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).
