Análisis miARN exosomal en células no pequeñas del cáncer de pulmón (NSCLC) de plasma de los pacientes a través de qPCR: una herramienta de biopsia líquida factible
Summary
This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.
Abstract
The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2–ΔΔct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.
Introduction
La baja tasa de supervivencia en NSCLC (células no pequeñas de cáncer de pulmón) pacientes se debe principalmente a la limitada eficacia de los tratamientos en la enfermedad avanzada y la mala detección precoz 1. La activación de mutaciones en el gen EGFR, que se han descubierto en una subpoblación de pacientes con NSCLC, se conocen para conferir sensibilidad a inhibidores de la tirosina quinasa (TKIs). Desafortunadamente, la mayoría de los pacientes con CPNM EGFR mutados desarrollan resistencia TKI 2. Especialmente en este contexto, un diagnóstico correcto es obligatorio. En general, debido a la localización de los tumores, la obtención de tejido de la biopsia en el CPNM no siempre es factible. Por lo tanto, están en curso estudios que utilizan métodos no invasivos para obtener estos datos biológicos. Los exosomas son descritos como componentes de biopsia líquidos que podrían investigarse con el fin de obtener los valores de diagnóstico y pronóstico con técnicas no invasivas 3.
Los exosomas son nanovesículas (40 – diámetro 100 nm) de correoorigen ndocytic que son liberados por diferentes tipos de células, tanto en condiciones fisiológicas y patológicas 4. Pueden transportar proteínas, lípidos, mRNA y microRNA. Por otra parte, varios estudios sugieren un papel pleiotrópico de exosomas derivados de tumores, que pueden influir en el crecimiento y supervivencia de las células tumorales, la angiogénesis, del estroma y remodelación de la matriz extracelular y resistencia a los medicamentos 5.
Los microARN (miRNA) son ARN no codificante corta que están involucrados en la regulación post-transcripcional, la unión de la 3'-UTR de los ARNm diana y que lleva el ARNm a la degradación o con un no-traducción 6. clasificación selectiva de miRNAs en exosomas se ha descrito. En este contexto, recientemente se ha demostrado, in vitro e in vivo, un embalaje selectiva de miR-21 (un miARN conocido con efectos oncogénicos) en exosomas liberados por las líneas celulares de leucemia mielógena crónica después del tratamiento curcumina 7.
losperfil exosomal miRNA es similar al perfil de miARN del tumor primario y esta característica puede ser explotada en el diagnóstico precoz y el pronóstico 3. En concreto, existe la posibilidad de caracterizar, por PCR en tiempo real, miRNAs seleccionados correlacionados con el perfil molecular de la enfermedad, por ejemplo., Las mutaciones de EGFR entre otros 8.
A continuación, se describe el análisis de un panel seleccionado de NSCLC correlacionada-miRNAs 8-9 que fueron aisladas de los exosomas liberados en la sangre de pacientes con CPNM. Después de obtener el consentimiento informe de informar de los pacientes, plasma de 12 pacientes con CPNM y 6 controles sanos, se analizaron. El aislamiento exosoma se realizó con el kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante. Antes de aislamiento exosome, las muestras de plasma se trataron con ARNasa, con el fin de degradar contaminantes circulante miRNAs. Se decidió realizar este análisis con un kit comercial debido a la estandarización limitado de otra técques (por ejemplo., ultracentrifugación) que es especialmente importante cuando se trabaja con muestras clínicas. Este kit incluye un tratamiento de proteinasa K, lo que degradará la ARNasa, y por lo tanto disminuye el riesgo de degradar miRNAs exosomal después de la lisis de exosomas. análisis microARN se realizó por análisis PCR sensible y específico en tiempo real; mir-1228-3p se utilizó como control endógeno y se normalizaron los datos de acuerdo a la fórmula 2 – ΔΔct. Los valores de control se utilizan como línea de base y resultados se muestran en una escala logarítmica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con este protocolo combinado que era posible llevar a cabo un análisis de miARN exosomal a partir del plasma de los pacientes con CPNM. Estos datos pueden reflejar el estado de la enfermedad, pero esto debe ser confirmado por estudios posteriores.
El protocolo utilizado en este artículo se basa en un kit comercial para el aislamiento de exosomas. La razón era que los otros procedimientos de aislamiento conocidos (por ejemplo., La densidad de ultracentrifugación en gradiente) req…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was also financed by MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.
Materials
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
- Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
- Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
- Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
- Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
- Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
- Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR’1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).
