Exosomal تحليل ميرنا في الخلية غير الصغيرة سرطان الرئة (NSCLC) المرضى البلازما من خلال QPCR: والممكنة السائل أداة خزعة
Summary
This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.
Abstract
The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2–ΔΔct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.
Introduction
ويرجع ذلك أساسا إلى فعالية محدودة من العلاجات في مرحلة متقدمة من المرض وسوء الكشف المبكر عن 1 معدل البقاء على قيد الحياة وانخفاض في NSCLC (خلية صغيرة غير سرطان الرئة) من المرضى. تفعيل الطفرات في الجينات اريسا، التي تم اكتشافها في جزء من السكان من المرضى NSCLC، ومن المعروف أن تمنح حساسية لالتيروزين كيناز مثبطات (TKIs). وللأسف، فإن الغالبية العظمى من المرضى NSCLC EGFR تحور تطوير المقاومة TKI 2. خاصة في هذا السياق، إلى التشخيص الصحيح إلزامي. بصفة عامة، نظرا لتوطين أورام، والحصول على الأنسجة الخزعة في NSCLC ليس دائما ممكنا. لذلك، العديد من الدراسات جارية أن استخدام أساليب غير الغازية للحصول على هذه البيانات البيولوجية. موصوفة Exosomes كمكونات الخزعة السائلة التي يمكن أن يتم التحقيق من أجل الحصول على قيم التشخيصية والنذير مع التقنيات غير الغازية 3.
Exosomes هم nanovesicles (40-100 قطر نانومتر) من البريدأصل ndocytic التي تم إصدارها من قبل أنواع مختلفة من الخلايا في كل الظروف الفسيولوجية والمرضية 4. ويمكن أن تحمل البروتين، والدهون، ومرنا والرنا الميكروية. وعلاوة على ذلك، تشير العديد من الدراسات إلى دور عديد المظاهر من ورم مشتقة exosomes، والتي يمكن أن تؤثر على النمو والبقاء على قيد الحياة من خلايا الورم، والأوعية الدموية، انسجة وخارج الخلية إعادة عرض المصفوفة ومقاومة العقاقير 5.
الرنا الميكروية (miRNAs) هي قصيرة RNA غير الترميز التي تشارك في تنظيم مرحلة ما بعد النسخي، ربط 3'-UTR للمن mRNAs هدف وقيادة مرنا إلى تدهور أو إلى غير الترجمة 6. وقد وصفت الفرز الانتقائي للmiRNAs إلى exosomes. في هذا السياق، في الآونة الأخيرة وقد تجلى، في التجارب المختبرية والحية، والتعبئة والتغليف الانتقائي للمير-21 (ميرنا المعروفة مع آثار أنكجنيك) في exosomes الصادرة عن خطوط الخلايا ابيضاض الدم النقوي المزمن بعد العلاج الكركمين 7.
الالملف الشخصي exosomal ميرنا يشبه الشخصية ميرنا من الورم الرئيسي ويمكن استغلال هذه الميزة في التشخيص المبكر والتشخيص 3. على وجه التحديد، وهناك إمكانية لتميز، من خلال الوقت الحقيقي PCR، miRNAs اختيار المترابطة مع المستوى الجزيئي للأمراض، على سبيل المثال.، والطفرات EGFR من بين أمور أخرى 8.
هنا، يتم وصف تحليل لوحة مختارة من المترابطة NSCLC-miRNAs 8-9 التي تم عزلها من exosomes صدر في الدم لمرضى NSCLC. بعد الحصول على تقرير الموافقة على إبلاغ من المرضى، والبلازما من 12 مريضا NSCLC و 6 الاصحاء، وقد تم تحليل. تم إجراء العزلة exosome مع عدة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قبل العزلة exosome، تم علاج عينات البلازما مع ريبونوكلياز، من أجل أن تتحلل الملوثات المنتشرة miRNAs. قررنا إجراء هذا التحليل مع مجموعة تجارية في نتيجة للتوحيد محدود من TECHNI الآخرينسؤال كان (على سبيل المثال، تنبيذ فائق) وهو أمر مهم خصوصا عند التعامل مع العينات السريرية. وتشمل هذه المجموعة علاج بروتين كاف، والتي سوف تؤدي إلى تدهور ريبونوكلياز، وبالتالي يقلل من خطر أن تتحلل miRNAs exosomal بعد تحلل exosome. أجري تحليل الرنا الميكروي من قبل في الوقت الحقيقي تحليل حساسية وخصوصية PCR. وقد استخدم مير 1228-3p كعنصر تحكم الذاتية وتم تطبيع البيانات وفقا للصيغة 2 – ΔΔct. وتستخدم القيم السيطرة كما الأساس، ويتم عرض النتائج في مقياس لوغاريتمي.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع هذا البروتوكول المشترك كان من الممكن إجراء تحليل ميرنا exosomal من البلازما من مرضى NSCLC. قد تعكس هذه البيانات على الحالة المرضية، ولكن هذا يحتاج إلى تأكيد من مزيد من الدراسة.
واستند البروتوكول المستخدم في هذه المقالة على عدة التجا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was also financed by MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.
Materials
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
- Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
- Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
- Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
- Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
- Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
- Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR’1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).
