Exosomal miRNA Analyse en non-small cell lung cancer (NSCLC) Plasma de patients Par qPCR: A Faisable Liquid Biopsie outil
Summary
This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.
Abstract
The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2–ΔΔct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.
Introduction
Le faible taux de survie dans le CPNPC (cancer non à petites cellules du poumon) des patients est principalement due à l'efficacité limitée des traitements dans la maladie avancée et la détection précoce pauvres 1. Des mutations activatrices du gène EGFR, qui ont été découverts dans une sous – population de patients atteints de CPNPC, sont connus pour conférer une sensibilité à la tyrosine kinase (ITK inhibiteurs). Malheureusement, la majorité des patients atteints de CPNPC EGFR muté développent une résistance de TKI 2. Surtout dans ce contexte, un diagnostic correct est obligatoire. D'une manière générale, en raison de la localisation de tumeurs, l'obtention d'un tissu de biopsie dans NSCLC est pas toujours possible. Par conséquent, plusieurs études sont en cours qui utilisent des méthodes non invasives pour obtenir ces données biologiques. Les exosomes sont décrits comme composants de biopsie liquides qui pourraient être étudiés afin d'obtenir des valeurs diagnostiques et pronostiques avec des techniques non-invasives 3.
Les exosomes sont des nanovésicules (40-100 nm de diamètre) de l'eorigine ndocytic qui sont libérés par les différents types de cellules à la fois dans des conditions physiologiques et pathologiques 4. Ils peuvent transporter des protéines, des lipides, des ARNm et microARN. En outre, plusieurs études suggèrent un rôle pleiotrope des exosomes tumorales dérivées qui peuvent influencer la croissance et la survie des cellules tumorales, l' angiogenèse, stroma et la matrice extracellulaire et le remodelage 5 résistance aux médicaments.
Les microARN (miARN) sont courts ARN non codantes qui sont impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle, liant l'extrémité 3 'UTR des ARNm cibles et conduisant l'ARNm à la dégradation ou à une non-traduction 6. Le tri sélectif des miARN dans exosomes a été décrite. Dans ce contexte, il a récemment été démontré in vitro et in vivo, un emballage sélectif de miR-21 (un miARN bien connu des effets oncogenes) dans les exosomes libérés par les lignées cellulaires de la leucémie myéloïde chronique après traitement curcumine 7.
leprofil exosomal miARN est similaire au profil miRNA de la tumeur primitive et cette caractéristique peut être exploitée dans le diagnostic précoce et le pronostic 3. Plus précisément, il est possible de caractériser, par PCR en temps réel miARN sélectionnés en corrélation avec le profil moléculaire de la maladie, par exemple., Les mutations de l' EGFR , entre autres 8.
Ici, l'analyse d'un panel sélectionné de NSCLC corrélé miARN 8-9 est décrite qui ont été isolés à partir des exosomes libérés dans le sang des patients atteints de CPNPC. Après avoir obtenu le rapport de consentement informer des patients, le plasma de 12 patients atteints de CPNPC et 6 témoins en bonne santé, ont été analysés. L'isolement exosomes a été réalisée avec le kit commercial en suivant le protocole du fabricant. Avant l'isolement exosomes, des échantillons de plasma ont été traités avec la RNase, afin de dégrader les contaminants circulant miARN. Nous avons décidé d'effectuer cette analyse avec un kit commercial en raison de la normalisation limitée d'autres techniques (par ex., l' ultracentrifugation) , ce qui est particulièrement important lorsque l'on travaille avec des échantillons cliniques. Ce kit comprend un traitement à la protéinase K, ce qui dégrade la RNAse, et diminue ainsi le risque de se dégrader miARN exosomales après exosomes lyse. l'analyse de micro-ARN a été réalisée par une analyse sensible et spécifique PCR en temps réel; miR-1228-3p a été utilisé comme contrôle endogène et les données ont été normalisés selon la formule 2 – ΔΔct. Les valeurs de contrôle sont utilisés comme référence et les résultats sont présentés sur une échelle logarithmique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avec ce protocole combiné, il était possible d'effectuer une analyse exosomal miRNA à partir du plasma de patients atteints de CPNPC. Ces données peuvent refléter l'état de la maladie, mais cela doit être confirmé par une étude plus approfondie.
Le protocole utilisé dans cet article était basé sur un kit commercial pour l'isolement des exosomes. La raison en est que les autres procédés d'isolement connus (par ex., Une ultracentrifugation à gradient de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was also financed by MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.
Materials
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
- Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
- Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
- Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
- Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
- Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
- Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR’1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).
