Exosomal miRNA Analyse på ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasient Plasma Gjennom qPCR: En Mulighets Flytende Biopsi Tool

Summary

This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.

Abstract

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2^{–ΔΔct 13}. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.

Introduction

Den lave overlevelse i NSCLC (ikke-småcellet lungekreft) pasienter er hovedsakelig på grunn av den begrensede effekten av behandlinger i avansert sykdom og dårlig tidlig deteksjon ^en. Aktiverende mutasjoner i EGFR-genet, som har blitt oppdaget i en undergruppe av NSCLC pasienter, er kjent for å gi følsomhet for tyrosinkinasehemmere (TKI). Dessverre, de fleste av EGFR muterte NSCLC pasienter utvikler TKI motstand ^2. Spesielt i denne sammenheng, er obligatorisk en korrekt diagnose. Generelt, på grunn av lokalisering av tumorer skaffe vevsprøver i NSCLC er ikke alltid mulig. Derfor flere studier pågår som bruker ikke-invasive metoder for å få tak i disse biologiske data. Exosomes beskrives som flytende biopsi komponenter som kan bli undersøkt for å få diagnostiske og prognostiske verdier med ikke-invasive teknikker ^3.

Exosomes er nanovesicles (40-100 nm diameter) av endocytic opprinnelse som er utgitt av ulike celletyper både i fysiologiske og patologiske tilstander ^4. De kan bære protein, fett, mRNA og microRNAs. Dessuten flere studier antyder en pleiotropisk rolle av tumor avledet exosomes, som kan påvirke vekst og overlevelse av tumorceller, angiogenese, stromal og ekstracellulær matriks ombygging og medikamentresistens ^5.

MicroRNAs (mirnas) er korte ikke-kodende RNA som er involvert i post-transkripsjonell regulering, binde det 3'-UTR av mål- mRNA og fører den til mRNA degradering eller til en ikke-oversettelse ^6. Selektiv sortering av miRNAs i exosomes har blitt beskrevet. I denne sammenheng, ble nylig demonstrert in vitro og in vivo, en selektiv pakking av MIR-21 (en velkjent miRNA med onkogene effekter) i exosomes utgitt av kronisk myelogen leukemi-cellelinjer etter at curcumin behandling ^7.

Deexosomal miRNA profilen er lik den miRNA profilen av den primære tumor, og denne funksjonen kan utnyttes i tidlig diagnose og prognose ^3. Nærmere bestemt, er det en mulighet for å karakterisere, ved sanntids-PCR, er valgt mirnas korrelert med molekyl profilen til sykdom, f.eks., EGFR mutasjoner blant andre ^8.

Her er analysen av et utvalgt panel av NSCLC-korrelert mirnas ^8-9 rives som ble isolert fra exosomes utgitt i blodet hos pasienter med NSCLC. Etter å ha innhentet informere samtykke rapport fra pasientene, plasma på 12 NSCLC pasienter og 6 friske kontroller ble analysert. Den exosome isolasjon ble utført med kommersielt sett i henhold til produsentens protokoll. Før exosome isolering, ble plasmaprøver behandlet med RNAse, for å nedbryte forurensnings sirkulerende mirnas. Vi bestemte oss for å utføre denne analyse med et kommersielt sett på grunn av den begrensede standardisering av andre tekniskespørs (f.eks., ultrasentrifugering) som er spesielt viktig når du arbeider med kliniske prøver. Dette settet inneholder en proteinase K-behandling, noe som vil forringe RNase, og dermed reduserer risikoen for å bli dårligere exosomal mirnas etter exosome lyse. MikroRNA analyse ble utført av sensitiv og spesifikk Real-Time PCR-analyse; mir-1228-3p ble anvendt som en endogen kontroll og data ble normalisert i henhold til formelen 2 ^{– ΔΔct.} Kontroll verdier brukes som grunnlinjen og resultatene er vist i en logaritmisk skala.

Protocol

1. Exosome Isolation Merk: isolering av exosomes fra plasmaprøver ble utført med et kommersielt kit, i henhold til produsentens protokoll og ved å legge RNase behandling: (alle disse trinnene må utføres med personlige og miljø beskyttende utstyr og følgende spesifikk prosedyre for håndtering av biologiske prøver ). Ta 1 ml plasma fra hver prøve, lagret ved -80 ° C, og plassere den på is. Sentrifuger prøven ved 2000 x g i 20 minutter ved romtemperatur; dette …

Representative Results

Totalt 12 plasma fra NSCLC pasienter og 6 friske kontroller ble behandlet med kommersielle kit for exosome isolasjon fra plasma. Hver prøve ble behandlet ved Western blot-analyse for å vurdere den exosomal markører ALIX (96 kDa) og TSG101 (43 kDa). Et eksempel på disse resultater er vist for 3 prøver i figur 1, noe som indikerer at exosome isolert fra plasmaprøver er mulig med denne protokollen. For å b…

Discussion

Med denne kombinerte protokollen var det mulig å utføre en exosomal miRNA analyse fra plasma av pasienter med NSCLC. Disse dataene kan gjenspeile sykdomsstatus, men dette må bekreftes av videre studier.

Protokollen som brukes i denne artikkelen var basert på et kommersielt kit for exosome isolasjon. Årsaken var at de andre kjente isolasjonsprosedyrer (f.eks., Tetthet ultrasentrifugering) krever mer manuelle rutiner, som fører til en begrenset standardisering. Ikke desto mindre…

Materials

Total exosome isolation kit (from plasma)	Invitrogen	4484450	Use Proteinase K treatment
Ribonuclease A	Sigma-Aldrich	R4875-100MG
ALIX Antibody (3A9)	Cell Signaling	2171S
TSG-101 Antibody (C-2)	SantaCruz Biotecnology	SC-7964
Anti-Mouse HRP 1ml	Cell Signaling	7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50	GE HealthCare	25-0500-71
Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit	Life Technologies	4366596
hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	002919
hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	000602
hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	000419
hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	002245
hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	000494
hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	000507
hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	000439
hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	000524
hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay	Life Technologies	002276
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG	Life Technologies	4440043