Exosomal miRNA Analys i icke-småcellig lungcancer (NSCLC) Patient Plasma genom qPCR: en möjlig Liquid biopsi Tool
Summary
This protocol describes the feasibility to perform miRNA profiling in exosomes, released in plasma of NSCLC patients, through a commercial exosome isolation kit with Proteinase K and RNAse treatments, in order to avoid circulating miRNAs contamination and evaluate their biomarker features in NSCLC.
Abstract
The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective tyrosine kinase inhibitors (TKIs). To optimize the use of these TKIs, the discovery of new biomarkers for early detection and disease progression is mandatory. These plasma-isolated exosomes can be used as a non-invasive and repeatable way for the detection and follow-up of these biomarkers. One ml of plasma from 12 NSCLC patients, with different mutations and treatments (and 6 healthy donors as controls), were used as exosome sources. After RNAse treatment, in order to degrade circulating miRNAs, the exosomes were isolated with a commercial kit and resuspended in specific buffers for further analysis. The exosomes were characterized by western blotting for ALIX and TSG101 and by transmission electron microscopy (TEM) analysis, the standard techniques to obtain biochemical and dimensional data of these nanovesicles. Total RNA extraction was performed with a high yield commercial kit. Due to the limited miRNA-content in exosomes, we decided to perform retro-transcription PCR using an individual assay for each selected miRNA. A panel of miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), all correlated with NSCLC disease, were analyzed taking advantage of the remarkable sensitivity and specificity of Real-Time PCR analysis; mir-1228-3p was used as endogenous control and data were processed according to the formula 2–ΔΔct 13. Control values were used as baseline and results are shown in logarithmic scale.
Introduction
Den låga överlevnaden i NSCLC (icke-småcellig lungcancer) patienter är främst på grund av den begränsade effekten av behandlingar i avancerad sjukdom och dålig tidig upptäckt en. Aktiverande mutationer i EGFR-genen, som har upptäckts i en subpopulation av NSCLC-patienter, är kända för att ge känslighet för tyrosinkinashämmare (TKI). Tyvärr är de flesta av EGFR muterade NSCLC patienter utvecklar TKI motstånd 2. Särskilt i detta sammanhang är en korrekt diagnos obligatoriskt. I allmänhet, på grund av lokalisering av tumörer, erhållande biopsivävnad i NSCLC är inte alltid möjligt. Därför flera studier pågår som använder icke-invasiva metoder för att få dessa biologiska data. Exosomes beskrivs som flytande biopsi komponenter som kunde undersökas för att få diagnostiska och prognostiska värden med icke-invasiva metoder 3.
Exosomes är nanovesicles (40-100 nm diameter) endocytic ursprung som frigörs genom olika celltyper i både fysiologiska och patologiska tillstånd 4. De kan bära protein, lipider, mRNA och mikroRNA. Dessutom har flera studier tyder på en pleiotrop roll av tumör härrör exosomes, som kan påverka tillväxt och överlevnad av tumörceller, angiogenes, stromala och extracellulära matrix remodeling och läkemedelsresistens 5.
MicroRNAs (miRNA) är korta icke-kodande RNA, som är involverade i post-transkriptionell reglering, bindning av 3'-UTR av målar mRNA och ledande mRNA för nedbrytning eller till en icke-översättning 6. Selektiv sortering av miRNA i exosomes har beskrivits. I detta sammanhang nyligen visades in vitro och in vivo, en selektiv packning av MIR-21 (en välkänd miRNA med onkogena effekter) i exosomes släpptes av kronisk myeloisk leukemi cellinjer efter curcumin behandling 7.
Deexosomal miRNA profil liknar miRNA profil primärtumören och denna funktion kan utnyttjas i tidig diagnos och prognos 3. Specifikt finns det en möjlighet att karakterisera, genom realtids-PCR, utvalda miRNA korrelerade med molekylprofilen för sjukdom, t ex., EGFR-mutationer bland andra 8.
Här, är en analys av en utvald panel av NSCLC-korrelerade miRNA 8-9 beskrivs som isolerades från exosomes frigörs i blodet hos NSCLC-patienter. Efter att ha inhämtat informera samtycke rapport från patienter, plasma av 12 NSCLC patienter och 6 friska kontroller, analyserades. Exosome isolering utfördes med kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll. Innan Exosome isolering, var plasmaprover behandlades med RNAse, i syfte att bryta ned kontamine cirkulerande miRNA. Vi beslutade att utföra denna analys med ett kommersiellt kit beroende på den begränsade standardisering av andra techniques (eg., ultracentrifugering) vilket är särskilt viktigt när man arbetar med kliniska prover. Detta kit innehåller en proteinas K-behandling, vilket kommer att försämra RNAse, och därmed minskar risken för att bryta ned exosomal miRNAs efter Exosome lys. MicroRNA Analys utfördes genom känslig och specifik realtids-PCR-analys; mir-1228-3p användes som en endogen kontroll och data normaliserades i enlighet med formeln 2 – ΔΔct. Kontrollvärden används som baslinje och resultaten visas i en logaritmisk skala.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med denna kombinerade protokoll var det möjligt att utföra en exosomal miRNA analys från plasma från NSCLC-patienter. Dessa data kan spegla sjukdomsstatus, men måste bekräftas av ytterligare studier.
Protokollet som används i denna artikel var baserad på ett kommersiellt kit för Exosome isolering. Anledningen var att de andra kända isoleringsförfaranden (t ex., Densitetsgradient ultracentrifugering) kräver mer manuella rutiner, vilket leder till en begränsad standardise…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was also financed by MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.
Materials
| Total exosome isolation kit (from plasma) | Invitrogen | 4484450 | Use Proteinase K treatment |
| Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R4875-100MG | |
| ALIX Antibody (3A9) | Cell Signaling | 2171S | |
| TSG-101 Antibody (C-2) | SantaCruz Biotecnology | SC-7964 | |
| Anti-Mouse HRP 1ml | Cell Signaling | 7076P2 | |
| RNAspin Illustra mini kit 50 | GE HealthCare | 25-0500-71 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4366596 | |
| hsa-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002919 | |
| hsa-miR-30b TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000602 | |
| hsa-miR-30c TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000419 | |
| hsa-miR-122 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002245 | |
| hsa-miR-195 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000494 | |
| hsa-miR-203 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000507 | |
| hsa-miR-103 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000439 | |
| hsa-miR-221 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 000524 | |
| hsa-miR-222 TaqMan MicroRNA assay | Life Technologies | 002276 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Life Technologies | 4440043 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
- Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
- Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
- Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
- Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
- Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
- Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
- Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR’1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).
