Måling af calcium Udsving Inden for reticulum af dyrkede glatte muskelceller Brug FRET-baserede Konfokal Imaging

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

Ca2 ⁺ er en meget vigtig ion findes i overflod i hver eneste celle i kroppen. Det har betydelige roller i mange forskellige cellulære funktioner, herunder vækst, formering, migrering, og apoptose ^1-4. Det er velkendt, at Ca2 ⁺ kan påvirke disse processer gennem både direkte og indirekte aktioner, og derfor kan ændringer i normale intracellulære koncentrationer af denne ion let føre til negative resultater for de berørte celler. SR betragtes som den største intracellulære Ca2 ⁺ butik i cellen ^5. Steady-state niveauer af Ca2 ⁺ i både SR og cytoplasma normalt vedligeholdt gennem konstant flux ind i og ud af de Ca ^{2 +} -transporting kanaler denne organel. De stressende forhold pålagt celler på grund af enhver form for skade eller sygdom er ofte forbundet med betydelige ændringer i SR Ca ^{2 +,} der går på at have langvarige effekter på hanalth af cellen. I de mest alvorlige tilfælde, at den manglende evne af en stresset celle genoprette og opretholde steady state SR Ca2 ⁺ niveauer kan endda kulminere i død ved apoptose ^6-8.

Aktuel forskning i cellulære Ca ^{2 +} dynamikker er begrænset af det faktum, at kun få studier test organel Ca ²⁺ butik indhold direkte ^9-11. Den mest almindelige praksis i stedet omfatter måling af cytoplasmatiske Ca2 ⁺ niveauer som indirekte målinger af ændringer i SR Ca2 ⁺ indhold ^12-14. I disse eksperimenter er Ca2 ⁺ almindeligvis induceres til at blive frigivet fra SR ved hjælp af farmakologiske midler forårsager organel s depletion (f.eks thapsigargin). Konklusioner derefter tegnet med hensyn til ændringer i SR Ca2 ⁺ baseret på udsving i de cytoplasmatiske Ca ^{2 +} koncentrationer. Trods muligheden resterende for efterforskerne at drage sådanne konklusioner i en rundkørsel manner, denne metode til SR Ca2 ⁺ måling er klart en indirekte måde at indsamle sådanne oplysninger, med mange begrænsninger vedrørende fortolkningen af indsamlede data. For at omgå denne klar begrænsning, er det nødvendigt at måle mængden af Ca2 ⁺ fundet direkte i SR luminale netværk.

Vital til det endelige resultat af at være i stand til direkte at registrere intraluminale SR Ca ^{2 +} niveauer er de cellekultur værktøjer og den Ca2 ⁺ indikator anvendes. For dataene henvises til i den nuværende manuskript, er det vigtigt at bemærke, at VSMC anvendte kom fra en frossen cellelinie. Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) + 10% serum fra nyfødt kalv (NCS) i løbet af passager 22-26 for de skitserede forsøg inkuberes ved en konstant 37 ° C med _5% CO2 forsyning. Hjælp af den aktuelle fremgangsmåde, for eksempel celler er blevet meget held dyrkes på en proteinblanding, der simulerer den ekstracellulæremiljø af mange forskellige typer af væv ^15. Vigtigt for succes langs venen af SR Ca2 ⁺ forskning er den type proteinblanding anvendes; i dette tilfælde en lav vækstfaktor sort var nødvendigt for at undgå bestanddele af dette værktøj i at påvirke den regelmæssige Ca2 ⁺ signalering og bevægelser forekommer konstant inden de testede celler. Efter en vellykket vækst i testceller, Ca ²⁺ indikatoren skal også effektivt introduceret til disse dyrkede celler. Dette er blevet muligt ved at anvende en adenoviral vektor, som bærer SR-bosiddende Ca2 ⁺ indikator D1SR. For at opnå en høj transfektionseffektivitet, celler inkuberes med virale vektorer i mindst 36-48 timer før billeddannelse. Dette præparat er et pålideligt værktøj til at måle Ca ^{2 +} transienter inden for SR lumen med høj nøjagtighed og reproducerbarhed.

D1SR indikator anvendes i denne protokol er en modificeret variant af D1ER Ca ²⁺ indicator, der oprindeligt blev skabt af Dr. Roger Tsien laboratorium ved University of California, San Diego, USA ^9,16. Den oprindelige D1ER tilhører en anden generation af genetisk indkodede Ca2 ⁺ indikatorer kaldet cameleons der viser Ca2 ⁺ følsomhed over et meget bredere område (0,5-160 uM) i forhold til tidligere Ca2 ⁺ indikatorer ^9,16. Den nye variant D1SR, en venlig gave fra Dr. Wayne Chen (University of Alberta, Canada), dog bærer en mutant calsequestrin sekvens (i stedet for en calreticulin sekvens som i den oprindelige D1ER). Mutanten calsequestrin har en reduceret binding til Ca2 ^+, der eliminerer problemet med at konkurrere med endogent calsequestrin i binding til Ca2 ⁺ i SR lumen ^11. Den D1SR indikator bærer en trunkeret forstærket cyan fluorescerende protein (CFP) og gult fluorescerende protein (YFP), der binder med en linker protein indeholdende modificeret calmodulin (CaM) og M13 (than 26-rest peptid med myosin letkæde-kinase, der binder til CAM) sekvenser. CAM-M13 sekvens er blevet modificeret for at forhindre M13 i at binde til endogen calmodulin. Også for at sikre SR fastholdelse, en calsequestrin sekvens er blevet tilføjet på 5'ende af FFP ^11. Når de bindes til Ca ^2+, CaM-M13 domæne gennemgår konformationelle ændringer, som resulterer i en forøgelse af energioverførsel mellem den flankerende FFP og YFP, som registreres som en stigning i FRET signal intensitet. På den anden side, når koncentrationen af SR luminal Ca2 ⁺ dråber, CaM-M13 domæne går gennem omvendte konformationsændringer, hvilket resulterer i et fald i energioverførsel mellem den flankerende FFP og YFP, og et betydeligt fald i FRET signal intensitet .

Protocol

Etik erklæring: Alle eksperimenter og procedurer blev udført i overensstemmelse med de Laboratory Biosafety retningslinjer fra University of British Columbia, Vancouver, Canada. 1. Forberedelse af 35 mm Glas-bund kultur retter til FRET-baserede konfokalmikroskopi Forbered plader under anvendelse af følgende procedure 36-48 timer før forsøg. Hent valgt gelatinøse protein blandingen og 0,25% trypsin-EDTA fra -20 ° C opbevaring og holde dem i mobil isbad indtil brug. BEMÆRK: Bel?…

Representative Results

Dette punkt eksempler på de resultater, der kan opnås ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde til at fange SR luminale Ca2 + -koncentration data, sammenlignet med den almindeligt anvendte måde til indirekte at måle ændringer til organel Ca 2+ butik koncentrationer ved at observere udsving i cytoplasmatisk Ca 2+ . Figur 1A viser et øjebliksbillede af et område af inter…

Discussion

Denne protokol beskriver transfektionen af VSMC med D1SR adenovirus at studere Ca2 ⁺ koncentrationer inden i hulrummet af SR. Denne fremgangsmåde giver mulighed for direkte måling af Ca2 ⁺ i denne organel samt dets bevægelse ind / ud af SR som følge af anvendelsen af forskellige calcium-bevægelige midler. Denne metode har mange fordele for efterforskere arbejder hen imod en samlet forståelse af, hvordan ændringer i SR og cytoplasmatiske Ca ²⁺ niveauer påvirke den samlede cellulæ…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.