Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

Introduction

^{Ca2 +} é um ião muito importante encontrada em abundância no interior de cada célula única no corpo. Ele tem papéis importantes em muitas funções celulares diferentes, incluindo o crescimento, proliferação, migração, e apoptose ^1-4. Está bem estabelecido que Ca ²⁺ pode afetar estes processos através de acções directas e indirectas, e, portanto, alterações nas concentrações intracelulares normais deste íon pode facilmente resultar em consequências negativas para as células afetadas. O SR é considerado como o maior de ^{Ca2 +} intracelular no interior da célula da loja ^5. Níveis estáveis ​​de Ca ^2+, tanto no SR e no citoplasma são normalmente mantida através de constante fluxo de entrada e saída dos Ca ²⁺ -Transporte canais dessa organela. As condições estressantes impostas células devido a qualquer tipo de lesão ou doença são comumente associados com mudanças significativas em Ca ²⁺ SR que passam a ter efeitos duradouros sobre o que eleALTH da célula. No mais severo dos casos, a incapacidade de uma célula salientou para recuperar e manter o estado estacionário SR níveis ^{de Ca2 +} podem ainda culminam na morte por apoptose ^6-8.

A pesquisa atual em celulares Ca ²⁺ dinâmica é limitada pelo fato de que poucos estudos teste organela Ca ²⁺ armazenar conteúdo diretamente ^9-11. A prática mais comum, em vez envolve a medição da citoplasmáticos níveis de Ca ²⁺ como medidas indiretas de mudanças na SR Ca ²⁺ conteúdo ^12-14. Nestas experiências, ^{Ca2 +} é normalmente induzido a ser libertado a partir da SR, através da utilização de agentes farmacológicos que causam depleção do organelo (por exemplo, tapsigargina). As conclusões são então desenhadas no que diz respeito a alterações SR Ca ²⁺ com base em flutuações nos citoplasmáticos concentrações ^{de Ca2 +.} Apesar da capacidade remanescente para os investigadores para desenhar tais conclusões em uma ma rotundaNNER, este método de SR Ca ²⁺ medida é claramente uma forma indireta para recolher essa informação, com muitas limitações relativas à interpretação dos dados coletados. A fim de contornar esta restrição clara, é necessário medir a quantidade de Ca ²⁺ encontrado diretamente na rede luminal SR.

Vital para o resultado final de ser capaz de gravar diretamente SR níveis intraluminais ^{Ca2 +} são as ferramentas de cultura celular e o indicador de ^{Ca2 +} usado. Para os dados referenciados no manuscrito actual, é importante notar que as VSMCs utilizados são provenientes de uma linha de células congelada. As células foram cultivadas em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de soro de vitelo recém-nascido (NCS) ao longo de 22-26 passagens para as experiências descritas, incubou-se a uma constante de 37 ° C com 5% de CO ₂ de alimentação. Usando o método actual, por exemplo, as células foram cultivadas com muito sucesso em uma mistura de proteína que simula o extracelularambiente de muitos tipos diferentes de tecido ^15. Importante para o sucesso ao longo da veia de Ca ²⁺ SR pesquisa é do tipo de mistura de proteína utilizada; Neste caso, uma variedade de baixo factor de crescimento foi necessário para evitar componentes desta ferramenta de afectar a sinalização ^{de Ca2 +} regular e movimentos ocorrem constantemente dentro das células testadas. Após o crescimento das células de teste bem sucedido, o indicador de ^{Ca2 +} deve também ser eficazmente introduzido para estas células em cultura. Isto tornou-se possível através da utilização de um vector adenoviral que realiza a ²⁺ D1SR indicador Ca-residente SR. Para alcançar uma elevada eficiência de transfecção, as células devem ser incubadas com vectores virais para, pelo menos, 36-48 horas antes da imagiologia. Esta preparação fornece uma ferramenta confiável para medir Ca ^{2 +} transientes dentro do lúmen SR com alta precisão e reprodutibilidade.

Indicador D1SR utilizado neste protocolo é uma variante modificada do D1ER ^{Ca2 +} indicator que foi originalmente criado pelo laboratório do Dr. Roger Tsien, da Universidade da Califórnia, San Diego, EUA ^9,16. O D1ER originais pertence a uma segunda geração de codificados geneticamente Ca ²⁺ indicadores chamados Cameleons que exibem Ca ²⁺ sensibilidades sobre uma gama muito mais ampla (0,5-160? M), em comparação com anteriores Ca ²⁺ indicadores ^9,16. O novo D1SR variante, uma simpática oferta do Dr. Wayne Chen (Universidade de Alberta, Canadá), no entanto, transporta uma sequência mutante calsequestrin (em vez de uma sequência de calreticulina como no D1ER original). O calsequestrin mutante tem uma reduzida ligação a ^{Ca2 +} que elimina o problema de competir com calsequestrin endógeno na ligação a ^{Ca2 +} dentro do lúmen ¹¹ SR. O indicador D1SR carrega uma proteína fluorescente truncada reforçada ciano (PCP) e proteína amarela fluorescente (YFP) que se ligam por uma proteína ligante contendo calmodulina modificado (CAM) e M13 (tele péptido 26-resíduo de miosina-quinase de cadeia leve que se liga a) sequências de came. A sequência de CaM-M13 foi modificado para evitar M13 de ligação a calmodulina endógena. Além disso, para assegurar a retenção de SR, uma sequência calsequestrin foi adicionado na extremidade 5 'de PCP ^11. Quando ligado ao ^{Ca2 +,} o domínio CAM-M13 passa por mudanças conformacionais que resultam num aumento na transferência de energia entre o PCP de flanqueamento e YFP, que é registado como um aumento na intensidade do sinal de FRET. Por outro lado, quando a concentração de SR Ca ²⁺ luminal diminui, o domínio CAM-M13 passa por mudanças conformacionais reversa, resultando numa diminuição na transferência de energia entre o PCP de flanqueamento e YFP, e uma queda significativa na intensidade do sinal de FRET .

Protocol

declaração de ética: Todos os experimentos e os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes Laboratório de Biossegurança da Universidade de British Columbia, Vancouver, Canadá.

1. Preparação de 35 placas de cultura mm com fundo de vidro para sistemas baseados em FRET microscopia confocal

1. Preparar as placas utilizando o seguinte procedimento 36-48 horas antes das experiências.
2. Recuperar mistura gelatinosa proteína escolhida e 0,25% de tripsina-EDTA a partir de -20 ° C de armazenamento e mantê-los num banho de gelo até à sua utilização móvel.
   NOTA: A mistura de proteína de revestimento só deve ser exposto à temperatura ambiente durante um breve período de tempo para impedir a mistura de solidificar antes da utilização. solução de tripsina também deve ser manter refrigeradas até serem necessários; Alternativamente, a tripsina pode ser recuperada do armazenamento a -20 ° C após o término do passo 1.5.
3. Prepare uma diluição de 1:25 da mistura de proteína: DMEM (sem soro adicional, refrigeradas). Transferir o volume apropriado da mistura de proteína / DMEM a cada placa a ser preparado. Para placas com fundo de vidro de 35 mm, adicionar cerca de 200 ul para cobrir integralmente círculo de vidro interna na parte inferior da placa.
4. Deixar placas de sentar-se por pelo menos 30 min no interior da cabine de segurança e em temperatura ambiente. DMEM morno com 10% NCS a 37 ° C em banho de água durante este período de tempo.
5. tripsina quente no banho de água a 37 ° C imediatamente antes de próximos passos.
6. Remover DMEM que está atualmente em frasco de cultura com uma pipeta de vidro e de sucção. Wash andar do balão com água morna PBS estéril para remover restantes resíduos DMEM.
7. Desalojar células musculares lisas anteriormente cultivada a partir de frasco de fundo:
   NOTA: balão foi estabelecida dia para este passo para permitir que as células atingem a confluência desejado (aproximadamente 80%) antes da preparação da placa. As células foram originalmente suspensos no frasco, em 20 ml de DMEM com 10% de NCS e incubou-se a 37 ° C com 5% de CO ₂ de alimentação durante 24 horas, após o que foi refrescado fornecimento de DMEM e as células foram devolvidas à incubadora. DMEM foi atualizado vésperary 48 horas seguindo estes passos iniciais até que as células atingiram confluência.
   1. Lavar rapidamente balão com 1 ml de tripsina e, em seguida, remover um ml de tripsina usando sucção.
   2. Adicionar em mais 1 ml de tripsina e deixam por longo período (aproximadamente 30-60 seg), balançando frasco para assegurar a enzima entra em contacto com todo o fundo do frasco.
   3. Observe o quanto as células têm destacado sob um microscópio, até ficar satisfeito com a separação da garrafa. solução sibilante tripsina alternativo e verificar separação celular, até ficar satisfeito com a proporção de células separadas da garrafa.
      NOTA: O frasco pode ser devolvidos para a incubadora durante aproximadamente 30-60 seg para acelerar este processo a 37 ° C.
   4. Uma vez que as células foram desalojadas utilizando tripsina, adicionar DMEM fresco com 10% de NCS ao frasco para parar a reacção de tripsina (volume suficiente de modo que a tripsina forma ^1/8 do volume total em balão).
      NOTA: Por exemplo, quando se utiliza um balão de cultura de 250 ml, isto7 ml de DMEM ser adicionados aos 1 mL de tripsina para resultar em 8 mL de solução de células.
8. Transferência resultante solução de células a partir do balão para um (rotulados) tubo de 50 ml limpo.
9. Adicionar 1 ml de DMEM fresco, mais de 10% NCS para cada prato sendo preparado (médio suficiente para durar 24 horas).
10. Inverta suavemente tubo contendo solução de células várias vezes para quebrar qualquer sedimento que podem ter se formado.
11. Pipeta desejado volume de solução de células suavemente misturado em cada placa.
    NOTA: O número SMCs recomendado banhado para este protocolo é de 0,5-0,8 x 10 ⁶ por 35 placas de cultura mm. Estes números podem variar, dependendo do tipo de células e devem ser testadas e modificado por cada laboratório.
12. Redemoinho cada placa completamente no sentido horário / anti-horário para assegurar a igualdade de distribuição das células do outro lado com fundo de vidro.

2. Transfecção transiente com vector adenoviral transportando D1SR Ca ²⁺ Indicador

1. Após a adição de medio e uma solução de células para cada placa, deixar as placas a incubar a 37 ° C com 5% de CO ₂ de alimentação durante pelo menos 1 h para permitir que as células para prender adequadamente ao vidro no fundo de pratos. Verificar as placas sob um microscópio em intervalos de 15 min, até que as células estejam claramente ligados.
2. Recuperar alíquota adenovírus-D1SR de armazenamento -80 ° C e manter em banho de gelo móvel para transportar a câmara de segurança biológica.
3. Pipeta dose desejada (multiplicidade de infecção de 100) de D1SR gelada a cada placa.
   NOTA: O cálculo para o volume de solução necessário adenoviral por placa depende do título do vírus na solução de reserva original, que é apresentado como a unidade de formação de placa (PFU). Com base na nossa experiência, recomenda-se uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100, o que é interpretado como o número de vírus ou de partículas necessárias para infectar uma célula de músculo liso (SMC) na placa de cultura.
4. Incubam-se as células infectadas a 37 ° C com 5% de CO ₂ de abastecimento S / N.
5. No dia seguinte, repor células com 1 ml de DMEM fresco mais 10% de NCS.
6. Incubar as placas numa incubadora humidificada a 37 ° C em 5% de CO ₂ O / N.

3. Medição da SR Luminal Ca ²⁺ Usando imagem confocal baseado em FRET

1. Seguindo O / N a incubação, retirar o meio de cultura a partir da placa.
2. Lava-se a placa de cultura com 1 ml de tampão HEPES-fisiológicas PSS quente contendo (em mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, glicose 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl ₂ 1,5 e _MgCl2 1 (pH 7,4) três vezes.
3. Adicionar 1 ml quente tampão HEPES-PSS fresco imediatamente antes do início da gravação.
4. Realizar imagem inicial usando o aplicativo FRET SE (sensibilizados Emission) (ou recurso similar) no software associado do microscópio confocal.
   1. Uma vez que a aplicação é aberta, clique na aba "Configuração" para ajustar as configurações para atingir condições experimentais desejados.
   <li> alterar manualmente as configurações de canal para que as células são animado em sequência a 440 nm (para o doador e FRET canais) e 513 nm (para o canal receptor). Recolher os comprimentos de onda de emissão a 488 nm (por doador) e 535 nm (para FRET e receptor).
   2. Definir a intensidade da luz na transmissão de 15%, com tempo de exposição de 150 ms excitação de células (de tempo de gravação para três sequencial doador PCP, fricção, e os canais de aceitadores YFP) e intervalos de 10 segundos entre as exposições.
5. Estabilizar placa na platina do microscópio.
6. Use o botão "Live" para verificar a resolução da imagem. Ajustar as configurações ainda mais até a resolução desejada seja atingida.
7. Ainda sob a aba "Configuração", ter uma imagem da amostra utilizando o botão "Capturar imagem".
8. Passando para o guia "Avaliação", escolha o método adequado para calcular os ganhos de eficiência FRET para as experiências que está sendo feito. Método 3, utilizando o cálculo raciométrica [E _A (i) = B / A], É recomendado para experimentos envolvendo Cameleons tais como o indicador D1SR.
9. Mudar para o separador "Graph" para ser capaz de observar os valores de intensidade sendo gravado em forma de gráfico durante o experimento.
10. Desenhe um ROI no visualizador de imagens para observar a intensidade média correspondente desta área de interesse no gráfico medida que a experiência prossegue.
    NOTA: Investigador também pode optar por desenhar várias ROIs e têm correspondentes intensidades ser gravadas e exibidas simultaneamente no gráfico. Alternativamente, os investigadores podem delinear um único ROI para a gravação inicial, e prossiga para contornar várias ROIs em um momento posterior, abrindo o ficheiro de experiência em uma data versão orientada a análise do software.
    NOTA: Para mais detalhes sobre as etapas necessárias para configurar experimentos baseados em FRET pode ser encontrado em FRET manuais Assistente de aplicação. Se o microscópio não está equipado com o Assistente de FRET, o seguinte protocolo pode ser usado para configurar os parâmetros paraa gravação manualmente.
11. Iniciar a gravação e permitem a recolha de dados para, pelo menos, 3 minutos para assegurar uma gravação basal constante do sinal antes da introdução do agente de interesse.
12. Introduzir Ca ²⁺ -Mover agente (por exemplo, 2 uM tapsigargina; 100 nm endotelina-1) como uma ferramenta para esgotar SR Ca ^2+, pipetando manualmente a dose pré-determinada directamente para a placa a um ponto tão próximo da região de interesse sendo registados como possível. Continuar a gravar para um tratamento pós tempo desejado.
13. Captura raciométrica FRET imagens em série (512 x 512 pixels) com um objectivo de imersão em óleo 63X do microscópio confocal invertido usando o aplicativo FRET SE.
14. Recolha de dados resultantes da representação gráfica de um conjunto de 5-10 PMEs em cada região de interesse (ROI) e, posteriormente, formatar e analisar usando software baseada em estatísticas.
    1. Para salvar dados para uso posterior, clique com o botão direito sobre o traço gravado e escolha a opção "Exportar" para save a planilha com intensidades de sinal médios registados na unidade escolhida pelo investigador.
    2. Normalizar os dados de cada experiência individual, dividindo cada dado pelo valor de intensidade de partida observada no ponto de tempo 0 seg.
    3. Importar dados normalizados de planilhas em um arquivo de projeto programa estatístico, copiando e colando linhas de dados relevantes a partir de sua origem planilha / seg manualmente.
    4. gerar automaticamente gráficos correspondentes aos conjuntos de dados colado no programa.
       NOTA: As configurações padrão do programa gerar gráficos de linhas de dados importados. Tipo de gráfico exibido pode ser modificado, clicando no botão "Escolher um tipo diferente de gráfico", sob a "mudança" de título encontrados dentro da barra de ferramentas principal.
    5. dados do pool que representam vários ensaios independentes dentro de um grupo maior de experiências idênticas em uma única folha de dados para produzir um rastreio média para o teste específico realizado.
4. Preparação do citoplasmática ^{de Ca2 +} Indicador
1. Dissolve-se 0,0125 g de ácido Pluronic (PA) em 1 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO), em um tubo de microcentrífuga de preto (pode ter que aquecer o tubo em banho-maria móvel para ajudar a dissolver PA).
2. Recuperar um tubo (50 ug) do ^{Ca2 +} citoplasmático corante indicador (Fluo-4 AM) a partir do armazenamento a -20 ° C.
3. Enrole o tubo de tinta em papel alumínio para protegê-lo tanto quanto possível do contato com a luz.
4. Pipetar 45 ul da solução de DMSO + PA para dentro do tubo que contém o corante. Enrole solução DMSO + PA em papel alumínio e armazenar a RT.
5. Misturar o conteúdo do tubo completamente solução pipetando para cima e para baixo várias vezes. Em alternativa, o tubo de tingimento sonicar durante 10 min.
   NOTA: Qualquer um dos métodos de distribuição completamente do corante ao longo da solução de DMSO + PA será suficiente; é simplesmente uma questão de preferência do investigador. Se o investigador decide sonicar solução, eledeve ser feito em uma área isolada / sala onde os outros não serão afetados pelo barulho. Investigador também deve usar silenciadores pesadas para proteger os ouvidos.
   1. Se sonicação solução, insira tubo embrulhado em papel alumínio contendo o corante dentro de um suporte de tubos de espuma e coloque dentro do banheiro sonicator 2/3 (com dH ₂ O).
   2. Lugar banho de ultra-sons na área isolada / quarto e máquina de alimentação (garantir headwear proteção está no lugar antes de iniciar o processo de sonicação). Deixe espaço e deixar máquina funcionando por 10 minutos antes de desligá-lo e recuperar o tubo (manter envolvido em folha para proteger da luz por tanto tempo quanto possível).
6. Alíquota da solução agora cuidadosamente misturados em tubos de microcentrífuga escuro (5 uL por tubo, deve ser capaz de fazer 10 tubos no total).
7. Enrole cada tubo da alíquota em folha. tubos de rotular e armazenar em dessecante a -20 condições ° C até utilização.

5. Medição de ^{Ca2 +} citoplasmática

1. Siga os passos em 1,1-1,12 para preparar placas de cultura de PMEs da aorta de ratos.
2. Remover o meio de cultura da placa de 48 horas após cultura.
3. Remova a alíquota previamente preparada de ^{Ca2 +} citoplasmático indicador (5 ul) de armazenamento de -20 ° C e mantida no banho de gelo até à sua utilização móvel.
4. Lava-se a placa de cultura com 1 ml de tampão HEPES-fisiológicas PSS quente contendo (em mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, glicose 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl ₂ 1,5 e _MgCl2 1 (pH 7,4) três vezes.
5. Misture o indicador com 1 ml de warm HEPES-PSS e carregá-lo sobre a placa de cultura.
6. Incubar as SMC com o indicador durante 1 h à TA (24 ° C).
7. Remover indicador da placa de cultura e lavar com 1 ml quentes fisiológicas HEPES-PSS-tampão três vezes.
8. Adicionar 1 ml quente tampão HEPES-PSS fresco imediatamente antes do início da gravação.
9. Capturar imagens em série (512 x 512 pixels) com um 63X oobjectivo IL-imersão do confocal microscópio invertido.
   1. alterar manualmente as configurações de modo que as células são animado a 488 nm, e os comprimentos de onda de emissão são recolhidos a 555 nm com uma velocidade de 700 Hz.
   2. Definir a intensidade da luz na transmissão de 15%, com 150 ms de tempo de exposição de células de excitação (a quantidade de tempo que as células são expostas à luz, a intervalos de tempo designados durante a gravação) e intervalos de 5 seg entre as exposições.
10. Estabilizar placa no palco microscópio e começar a gravar.
11. Da ficha, pelo menos, 3 minutos para assegurar uma gravação basal constante do sinal antes da introdução do agente de interesse.
12. Introduzir Ca ²⁺ -Mover agente (por exemplo, tapsigargina 2¼m) como uma ferramenta para esgotar SR Ca ²⁺ (como descrito no passo 3.16) e continuar a gravar para a quantidade desejada de tempo de pós-tratamento.
13. Ficha intensidade de sinal usando software específico para microscópio através da média Si fluorescênciagnals (F / F ₀₎ a partir de um aglomerado de 5-10 CML em cada região de interesse (ROI). Recolha, formato e analisar os dados resultantes de imagem usando o software de análise de dados. Veja Passos 3.18.1-3.18.5 para a descrição da recolha de dados e análise utilizando este software.

Representative Results

Esta secção fornece exemplos de resultados que podem ser obtidos usando o método descrito para capturar dados de concentração de SR Ca ²⁺ luminais, em comparação com a forma geralmente empregues de medir indirectamente a alterações organelo Ca ²⁺ concentrações armazenar observando flutuações em Ca ²⁺ citoplasmático .

A Figura 1A mostra um instantâneo de uma região de interesse (ROI) da cultura SMC transfectadas com adenovírus D1SR no canal YFP (514 nm de excitação / 535 nm de emissão). Tal como mostrado, embora todas as SMC são positivas para a expressão D1SR, é evidente que os níveis de expressão para o indicador D1SR variar entre células diferentes dentro do mesmo ROI. A Figura 1B mostra uma projecção 2-D de uma imagem de fluorescência de um SMC transfectadas com o D1SR adenovírus (canal YFP), que apresenta uma imagem clara do Ca ²⁺ distribuiçãodentro da rede luminal SR expansiva. Figura 1C apresenta a distribuição indicador D1SR na SMC usando PCP (440/488 nm), FRET (440/535 nm) e YFP (514/535 nm) filtros passa-banda.

Também mostram exemplos de traços de sinal ^{de Ca2 +} obtidos através da monitorização do movimento deste ião alvo na SR, utilizando o teste de exposição aguda clara de células com um agente SR esvaziamento tapsigargina (2 uM) (Figura 2). Como mostrado na Figura 2A e 2B, tapsigargina induz uma queda na SR teor ^{de Ca2 + ([Ca2 +]} _SR).

Na Figura 3A, temos mostrado imagens representativas de SMCs cultivadas carregadas com o indicador de ^{Ca2 +} citoplasmático tratada com o agente de tapsigargina SR esvaziamento (2 uM). O pico transitória observada no sinal gravado Ca ²⁺ ( 2+ no citoplasma do SMC, mesmo que a fonte dos transientes ^{de Ca2 +} não podem ser explicitamente identificadas.

A Figura 4A mostra instantâneos representativos de SMCs cultivadas que expressam o indicador D1SR SR de cálcio e tratadas com 100 nM de endotelina-1. Tal como mostrado em ambas as Figuras 4A e 4B, a endotelina-1 induz uma queda lento, mas constante no teor de cálcio SR, conforme medido por uma queda no sinal de FRET D1SR. Como é evidente, o protocolo de FRET permite raciométrica importante estudo de Ca ²⁺ movimentos directamente relacionados com o modo de acção do agente utilizado. A mensuração de movimento deste íon na / da maior Ca ²⁺ loja na célula dessa maneira é útil para fornecer resultados representante do Ca ²⁺ dinâmica directamente referentes às ações do SR ou devido à mudança s em ambiente lúmen SR.

Figura 1. Distribuição da SR Ca ²⁺ D1SR indicador em SMC aorta de ratos. (A) Imagem representativa que descreve a cultura SMC transfectadas com D1SR andenoviral vector no posto de infecção de 48 horas. (B) de projecção 2-D de uma imagem de fluorescência de distribuição D1SR num SMC cultivadas utilizando canal YFP (514 nm de excitação / emissão 535 nm). (C) snapshot Representante de um SMC transfectadas com indicador D1SR usando PCP (440/488 nm), FRET (440/535 nm) e YFP (514/535 nm) filtros passa-banda. Barras de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

/files/ftp_upload/53912/53912fig2.jpg "/>
Figura 2. tapsigargina provoca uma queda significativa na [Ca ^2+] _SR. (A) em tempo real instantâneos PseudoColor (FRET) do canal de SMC aórticas de rato em cultura transfectadas com D1SR e tratados com 2 uM de tapsigargina mostrando um decréscimo na intensidade do sinal indicando uma queda significativa na SR conteúdo ^{de Ca2 +} devido ao Ca libertação induzida por thapsigargin ^2+. (B) traço Representante para F / F ₀ valor em SMC cultivadas tratadas com 2 mM thapsigargin confirmando uma queda significativa na _SR ^[2+ Ca]. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. tapsigargina provoca um aumento significativo no Ca ²⁺ citoplasmático ([Ca ^2+] _i). (A) instantâneos representativos de SMC aórticas de rato em cultura carregadas com o indicador citoplasmática ^{de Ca2 +,} e tratada com 2 uM de tapsigargina. Como mostrado, tapsigargina provoca um aumento significativo da intensidade de sinal no interior do citoplasma, devido à libertação de ^{Ca2 +} a partir da SR. (B) traço Representante para F / F ₀ valor em SMC cultivadas tratadas com 2 M de thapsigargin. O aumento representado no sinal de ^{Ca2 +} é considerado proporcional à quantidade de ^{Ca2 +} liberado do SR. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. A endotelina-1 provoca uma queda significativa na [Ca ^2+] _SR. (A) em tempo real instantâneos PseudoColor (FRET) do canal de SMC aórticas de rato em cultura transfectadas com D1SR e tratados com 100 nm de endotelina-1 que mostra uma lenta mas diminuição constante na intensidade do sinal indicando uma queda significativa na SR conteúdo ^{de Ca2 +} devido ao Ca libertação induzida por endotelina ²⁺ para o SR. (B) traço Representante para F / F ₀ valor em SMC cultivadas tratadas com 100 nm de endotelina-1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este protocolo descreve a transfecção de VSMC com o adenovírus D1SR para estudar as concentrações ^{de Ca2 +} no interior do lúmen da SR. Este método permite a medição directa do ^{Ca2 +} neste organelo, bem como o seu movimento para dentro / para fora da SR, como resultado da aplicação de diferentes agentes de movimento de cálcio. Este método tem muitas vantagens para os investigadores que trabalham no sentido de uma compreensão abrangente de como as mudanças para o SR e citoplasmáticos níveis de Ca ²⁺ afetar a saúde celular geral e como essas mudanças são inter-relacionados. Observação tradicional de intracelular movimento Ca ²⁺ envolve o rastreamento de alterações em apenas níveis citoplasmáticos Ca ^2+. Uma importante vantagem derivada do uso do D1SR ou semelhantes construções, por conseguinte, é a capacidade para controlar o movimento deste ião envolvendo um organelo específico, tal como o SR, em vez de ter que tirar conclusões vagos sobre o efeito dos agonistas sobre a SR pelaindirectamente observando alterações para citoplasmáticos níveis de Ca ²⁺ induzidos por tal manipulação. Na mesma ordem de ideias, os agentes que servem para afetar SR ^{Ca2 +} especificamente pode ser mais eficientemente utilizado para avaliar os seus efeitos sobre ambos organela e celulares concentrações ^{de Ca2 +} wide-celulares e saúde em geral. É devido a estas vantagens que a transfecção de células de cultura com uma D1SR fornece directa, bem como de cortesia, método de medição de alterações mais para o SR níveis intraluminais Ca ^2+. Também de importância é o fato de que este modelo oferece uma ferramenta para medir alterações na concentração de ^{Ca2 +} dentro da rede SR em resposta a agentes farmacológicos ou fisiológicas que são conhecidas para induzir estresse celular ou respostas funcionais específicas. Isso será possível através da geração de uma curva de calibração para o indicador D1SR em qualquer célula de interesse. A concentração de cálcio dentro do RE / SR pode então ser calculado pela proporção D1SR calibração normalizada (F / F ₀) Contra a curva padrão de calibração conforme descrito anteriormente ^{10, 11.}

A limitação do protocolo descrito aqui é a falta de informação disponível sobre o uso da construção D1SR em outros tipos de células. Este método tem até agora sido bem sucedida para CML de rato nos nossos estudos múltiplas vezes ^13-15, embora a sua utilização com outros tipos de células até agora tem sido limitada. Para o sucesso deste método, é vital que todas as precauções foram tomadas para assegurar a progressão saudável dos passos de cultura de células. Por isso, é importante o uso de um material apropriado, permitindo o crescimento de células em placas, como as muitas substâncias gelatinosas à base de proteínas disponíveis para compra que provaram para promover o crescimento suficiente de PMEs da aorta de ratos em placas de microscopia com fundo de vidro. Variabilidade no sucesso da transfecção com D1SR e de imagem posterior pode ser observado se as células não estão preparados durante suas passagens ideais e em alta confluência. Alterações à phenotype inerente ao uso prolongado da mesma linha de células pode resultar em transfecção e sub-óptima de sinal fraco a ser obtido na fase de imagem. As limitações envolvidas na utilização deste método são, por conseguinte, principalmente aqueles tornada inevitável pela cultura celular trabalho requerida, como experiências utilizando o construto D1SR deve estar preparado para, pelo menos, 36-48 horas antes da sua execução para garantir uma confluência de células e para a imagiologia tempo suficiente para a incubação de células crescendo com o adenovírus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.