संवर्धित चिकनी मांसपेशियों का उपयोग कोशिकाओं की sarcoplasmic जालिका के भीतर कैल्शियम उतार चढ़ाव का मापन झल्लाहट आधारित Confocal इमेजिंग

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

सीए ² एक बहुत ही महत्वपूर्ण आयन शरीर में हर एक कोशिका के भीतर बहुतायत में पाया जाता है। यह विकास, प्रसार, प्रवास, और apoptosis ^1-4 सहित कई अलग अलग सेलुलर कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका है। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि सीए ² प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष कार्यों के माध्यम से इन प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं, और इसलिए, इस आयन के सामान्य intracellular सांद्रता में परिवर्तन आसानी से प्रभावित कोशिकाओं के लिए नकारात्मक परिणामों में परिणाम कर सकते हैं। एसआर सबसे बड़ा intracellular सीए ^{2 + 5} सेल के भीतर दुकान के रूप में माना जाता है। दोनों एसआर और कोशिका द्रव्य में सीए ² स्थिर राज्य स्तर सामान्य रूप में और इस organelle के सीए ² -transporting चैनलों के बाहर निरंतर प्रवाह के माध्यम से रखा जाता है। चोट या बीमारी के किसी भी रूप के कारण कोशिकाओं पर लगाया तनावपूर्ण स्थितियों सामान्यतः एसआर सीए में महत्वपूर्ण परिवर्तन ²⁺ उस पर लंबे समय से स्थायी प्रभाव है वह पर जाने के साथ जुड़े रहे हैंसेल के alth। अधिकांश मामलों में गंभीर में, एक जोर दिया सेल की अक्षमता की वसूली और स्थिर अवस्था एसआर सीए ^{2 +} बनाए रखने का स्तर भी apoptosis ^6-8 से मौत में culminate सकता है।

सेलुलर सीए ² गतिशीलता में वर्तमान अनुसंधान तथ्य यह है कि कुछ अध्ययनों परीक्षण organelle सीए ² दुकान सामग्री सीधे ^9-11 द्वारा सीमित है। सबसे आम अभ्यास के बजाय एसआर सीए ² सामग्री ^12-14 में परिवर्तन का अप्रत्यक्ष माप के रूप में cytoplasmic सीए ² के स्तर की माप शामिल है। इन प्रयोगों में, सीए ² सामान्यतः organelle की कमी के कारण औषधीय एजेंटों (जैसे thapsigargin) के उपयोग के माध्यम से एसआर रिलीज होने के लिए प्रेरित किया है। निष्कर्ष तो एसआर सीए ² में परिवर्तन cytoplasmic सीए ² सांद्रता में उतार-चढ़ाव के आधार पर करने के संबंध में तैयार कर रहे हैं। एक राउंडअबाउट एमए में इस तरह के निष्कर्ष आकर्षित करने की क्षमता जांचकर्ताओं के लिए शेष होने के बावजूदnner, एसआर सीए ² माप की इस पद्धति स्पष्ट रूप से इस तरह की जानकारी, एकत्र डेटा की व्याख्या के विषय में कई सीमाओं के साथ बटोरने के लिए एक अप्रत्यक्ष तरीका है। आदेश में यह स्पष्ट प्रतिबंध बाईपास के लिए, यह एसआर ल्यूमिनल नेटवर्क के भीतर सीधे पाया सीए ² की मात्रा को मापने के लिए आवश्यक है।

सीधे intraluminal एसआर सीए ² स्तरों को रिकॉर्ड करने में सक्षम होने के अंतिम परिणाम के लिए महत्वपूर्ण सेल संस्कृति उपकरण और इस्तेमाल किया सीए ^{2 +} सूचक हैं। डेटा वर्तमान पांडुलिपि में संदर्भित के लिए, यह ध्यान दें कि इस्तेमाल किया VSMCs एक जमे हुए सेल लाइन से आया है महत्वपूर्ण है। प्रकोष्ठों Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) + 10% नवजात बछड़ा सीरम (NCS) उल्लिखित प्रयोगों के लिए मार्ग के 22-26 वर्षों में, 5% सीओ ₂ की आपूर्ति के साथ एक निरंतर 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated में सुसंस्कृत थे। वर्तमान पद्धति का प्रयोग, उदाहरण के लिए, कोशिकाओं की गई बहुत सफलतापूर्वक एक प्रोटीन मिश्रण है कि बाह्य simulates पर बड़े हो गए हैंऊतक ¹⁵ के कई अलग अलग प्रकार का माहौल है। एसआर सीए की नस-साथ सफलता के लिए महत्वपूर्ण ²⁺ अनुसंधान में इस्तेमाल किया प्रोटीन मिश्रण के प्रकार है; इस मामले में, एक कम वृद्धि कारक किस्म नियमित रूप से सीए ² सिगनल को प्रभावित करने और आंदोलनों को लगातार परीक्षण किया कोशिकाओं के भीतर से होने वाली इस उपकरण के घटकों से बचने के लिए जरूरी हो गया था। परीक्षण कोशिकाओं के सफल विकास के बाद, सीए ^{2 +} सूचक भी प्रभावी ढंग से इन संवर्धित कोशिकाओं के लिए पेश किया जाना चाहिए। यह एक adenoviral वेक्टर एसआर रहने वाले सीए ^{2 +} सूचक D1SR किया जाता है कि का उपयोग करके संभव हो गया है। एक उच्च अभिकर्मक दक्षता प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं इमेजिंग के लिए पहले कम से कम 36-48 घंटे के लिए वायरल वैक्टर के साथ incubated किया जाना चाहिए। यह तैयारी सीए को मापने के लिए उच्च सटीकता और reproducibility के साथ एसआर लुमेन के भीतर ^{2 +} यात्रियों एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है।

D1SR इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सूचक D1ER सीए का एक संशोधित संस्करण है ²⁺ मैंndicator कि मूल रूप से कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में डॉ रोजर वाई Tsien की प्रयोगशाला, सैन डिएगो, अमेरिका ^9,16 द्वारा बनाया गया था। मूल D1ER पिछले सीए ² संकेतक ^9,16 की तुलना में है कि एक बहुत व्यापक रेंज (0.5-160 माइक्रोन) के पर प्रदर्शित सीए ² संवेदनशीलता आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए ² संकेतक cameleons कहा जाता है की एक दूसरी पीढ़ी के अंतर्गत आता है। नए संस्करण D1SR, डॉ वेन चेन (अल्बर्टा, कनाडा के विश्वविद्यालय) से एक तरह का उपहार है, तथापि, एक उत्परिवर्ती calsequestrin अनुक्रम (के बजाय मूल D1ER में के रूप में एक calreticulin अनुक्रम) किया जाता है। उत्परिवर्ती calsequestrin एक सीए ^{2 है} कि ¹¹ लुमेन एसआर भीतर सीए ² के लिए बाध्य में अंतर्जात calsequestrin के साथ प्रतिस्पर्धा के मुद्दे को समाप्त करने के लिए बाध्य कम हो गया है। D1SR सूचक एक छोटा बढ़ाया सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी) और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) संशोधित calmodulin (सीएएम) और M13 युक्त एक लिंकर प्रोटीन से है कि बाँध (टी किया जाता हैवह मायोसिन प्रकाश श्रृंखला काइनेज कि सीएएम) दृश्यों को बांध के 26 अवशेषों पेप्टाइड। अभियान M13 अनुक्रम अंतर्जात calmodulin के लिए बाध्य से M13 को रोकने के लिए संशोधित किया गया है। इसके अलावा, एसआर प्रतिधारण सुनिश्चित करने के लिए, एक calsequestrin अनुक्रम सीएफपी ¹¹ की 5'अंत पर जोड़ा गया है। जब सीए ² के लिए बाध्य, कैमरा-M13 डोमेन गठनात्मक परिवर्तन है कि flanking सीएफपी और YFP, जो झल्लाहट संकेत तीव्रता में वृद्धि के रूप में दर्ज की गई है के बीच ऊर्जा हस्तांतरण में वृद्धि में परिणाम के माध्यम से चला जाता है। दूसरी ओर, जब एसआर ल्यूमिनल सीए के ^{2 +} एकाग्रता आ जाता है, अभियान-M13 डोमेन रिवर्स गठनात्मक परिवर्तन के माध्यम से, flanking सीएफपी और YFP, और झल्लाहट संकेत तीव्रता में उल्लेखनीय गिरावट के बीच ऊर्जा हस्तांतरण में कमी के परिणामस्वरूप चला जाता है ।

Protocol

आचार कथन: सभी प्रयोगों और प्रक्रियाओं ब्रिटिश कोलंबिया, वैंकूवर, कनाडा के विश्वविद्यालय की प्रयोगशाला जैव सुरक्षा के दिशा निर्देशों के साथ समझौते में आयोजित की गई। झल्लाहट आधारित confocal माइक्रोस्को?…

Representative Results

इस खंड में परोक्ष रूप से cytoplasmic सीए में उतार-चढ़ाव देख द्वारा सीए 2 दुकान सांद्रता organelle में परिवर्तन को मापने का आमतौर पर कार्यरत तरीके की तुलना में, परिणाम है कि वर्णित विधि का उपयोग एसआर ल?…

Discussion

इस प्रोटोकॉल एसआर के लुमेन भीतर सीए ² सांद्रता का अध्ययन करने के D1SR adenovirus साथ VSMCs के अभिकर्मक का वर्णन है। इस विधि इस organelle भीतर सीए ² के प्रत्यक्ष माप के साथ ही विभिन्न कैल्शियम से बढ़ एजेंटों के आवेदन…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.