Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Introduction

Ca ²⁺ ist ein sehr wichtiger Ionen im Überfluss in jeder einzelnen Zelle im Körper gefunden. Es hat eine bedeutende Rolle in vielen verschiedenen Zellfunktionen, einschließlich Wachstum, Proliferation, Migration und Apoptose ^1-4. Es ist bekannt, dass Ca ²⁺ diese Prozesse durch direkte und indirekte Aktionen beeinflussen können, und daher Änderungen an den normalen intrazellulären Konzentrationen dieses Ions in negativen Folgen für die betroffenen Zellen leicht zur Folge haben kann. Der SR wird als die größte intrazellulären Ca ²⁺ Speicher innerhalb der Zelle ⁵ betrachtet. Steady - State - Niveaus von Ca ²⁺ sowohl in der SR und Zytoplasma werden in der Regel durch konstanten Fluss in die und aus der ²⁺ -transportierenden Kanäle dieses Organell Ca gehalten. Die Stressbedingungen auf Zellen auferlegt aufgrund irgendeiner Form von Verletzungen oder Erkrankungen sind häufig mit erheblichen Veränderungen in der SR Ca ²⁺ zugeordnet , die auf langfristige Auswirkungen auf das zu haben , gehen eralth der Zelle. In der schwersten Fällen die Unfähigkeit eines gestressten Zelle erholen und stetigen Ca Zustand SR halten ²⁺ -Spiegel auch im Tod durch Apoptose ^6-8 gipfeln kann.

Die aktuelle Forschung in zelluläre Ca ²⁺ Dynamik wird durch die Tatsache , dass nur wenige Studien Test Ca ²⁺ Speicherinhalt direkt ^9-11 Organell. Die am weitesten verbreitete Praxis beinhaltet stattdessen Messung der cytoplasmatischen Ca ²⁺ -Spiegel als indirekte Messungen von Veränderungen in der SR Ca ²⁺ -Gehalt ^12-14. In diesen Experimenten wird ²⁺ Ca häufig induziert vom SR durch die Verwendung von pharmakologischen Mitteln freigesetzt werden verursacht die Abreicherung des Organell (zB Thapsigargin). Schlussfolgerungen werden dann im Hinblick auf Änderungen an SR Ca ²⁺ basierend auf Schwankungen der cytoplasmatischen Ca ²⁺ Konzentrationen gezogen. Trotz der Möglichkeit, für die Ermittler noch auf solche Schlussfolgerungen in einem Kreisverkehr ma ziehennner, diese Methode der SR Ca ²⁺ -Messung ist eindeutig ein indirekter Weg , solche Informationen zu sammeln, mit vielen Einschränkungen die Interpretation der gesammelten Daten. Um diese Einschränkung zu umgehen klar, ist es notwendig , die Menge an Ca ²⁺ gefunden direkt innerhalb des SR luminalen Netzwerk zu messen.

Entscheidend für das Endergebnis in der Lage, intraluminale SR Ca ²⁺ -Spiegel direkt aufzuzeichnen sind die Zellkultur - Tools und die Ca ²⁺ Indikator verwendet. Für die Daten im aktuellen Manuskript Bezug genommen wird, ist es wichtig zu beachten, dass verwendet VSMCs aus einer gefrorenen Zelllinie kam. Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% Serum von neugeborenen Kälbern (NCS) über Durchgänge 22-26 für die skizzierten Versuche bei einer konstanten 37 ° C mit 5% CO ₂ -Zufuhr inkubiert. Verwendung der aktuellen Methode, beispielsweise wurden auf einem Proteingemisch Zellen sehr erfolgreich gezüchtet, die die extrazelluläre simuliertUmgebung von vielen verschiedenen Arten von Gewebe ^15. Wichtig für den Erfolg entlang der Vene von SR Ca ²⁺ Forschung ist die Art der Proteinmischung verwendet; in diesem Fall war eine niedrige Wachstumsfaktor Vielfalt notwendigen Komponenten dieses Werkzeugs zu vermeiden , die aus dem regulären Ca ²⁺ Signalisierung zu beeinflussen und Bewegungen ständig innerhalb der getesteten Zellen auftreten. Nach dem erfolgreichen Wachstum von Testzellen, muss die Ca ²⁺ Indikator auch wirksam auf diese kultivierten Zellen eingebracht werden. Dies ist möglich geworden durch einen Adenovirus - Vektor verwendet, die die SR-Wohnsitz Ca ²⁺ trägt Indikator D1SR. Um eine hohe Transfektionseffizienz Zellen erreichen, müssen mit viralen Vektoren für mindestens 36-48 h vor der Bebilderung inkubiert werden. Dieses Präparat stellt ein zuverlässiges Werkzeug Ca ²⁺ Transienten innerhalb der SR - Lumen mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu messen.

D1SR Indikator in diesem Protokoll verwendet eine modifizierte Variante des D1ER Ca ²⁺ iNDIKATOR , die ursprünglich an der University of California von Dr. Roger Tsien Labor erstellt, San Diego, USA ^9,16. Die ursprüngliche D1ER gehört zu einer zweiten Generation von genetisch Ca ²⁺ codiert Indikatoren genannt Chamäleons , die ^9,16 Ca ²⁺ Empfindlichkeiten über einen viel breiteren Bereich (0,5 bis 160 & mgr; M) im Vergleich zur vorherigen Ca ²⁺ Indikatoren anzeigen. Die neue Variante D1SR ein freundliches Geschenk von Dr. Wayne Chen (University of Alberta, Canada), trägt jedoch eine mutante Calsequestrin Sequenz (anstelle eines Calreticulin-Sequenz, wie in der ursprünglichen D1ER). Die Mutante Calsequestrin hat Ca ²⁺ eine reduzierte Bindung , die bei der Bindung an Ca ²⁺ innerhalb des SR Lumen ¹¹ das Problem der im Wettbewerb mit endogenen Calsequestrin eliminiert. Der D1SR Indikator trägt ein verkürztes verstärkt cyan fluoreszierendes Protein (GFP) und gelb fluoreszierendes Protein (YFP), dass binden durch einen Linker-Protein enthält modifizierte Calmodulin (CaM) und M13 (ter 26-Rest-Peptid von Myosin-Leichtketten-Kinase, die an CaM) Sequenzen bindet. Die CaM-M13-Sequenz wurde modifiziert, M13, um zu verhindern, um endogene Calmodulin binden. Auch, um SR Retentions gewährleisten, ist eine Calsequestrin Sequenz wurde am 5'Ende der CFP ¹¹ hinzugefügt. Wenn gebunden an Ca ^2+, geht die CaM-M13 - Domäne durch Konformationsänderungen , die in einer Erhöhung der Energieübertragung zwischen den flankierenden CFP und YFP führen, was als ein Anstieg in der FRET - Signalintensität aufgezeichnet. Auf der anderen Seite, wenn die Konzentration von SR luminalen Ca ²⁺ abfällt, geht die CaM-M13 - Domäne durch Reverse Konformationsänderungen, was zu einer Verringerung der Energieübertragung zwischen den flankierenden CFP und YFP und einem signifikanten Abfall der Signalintensität FRET .

Protocol

Ethik-Anweisung: Alle Experimente und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Laboratory Biosafety-Richtlinien von der University of British Columbia, Vancouver, Kanada durchgeführt.

1. Herstellung von 35 mm Glasbodenkulturschalen für FRET-basierte konfokale Mikroskopie

1. Bereiten Sie Platten mit dem folgenden Verfahren 36-48 Stunden vor den Experimenten.
2. Abrufen gewählt gallertartig Proteinmischung und 0,25% Trypsin-EDTA von -20 ° C Lagerung und halten sie in mobilen Eisbad bis zur Verwendung.
   HINWEIS: Die Beschichtungsproteinmischung sollte nur für einen kurzen Zeitraum auf RT ausgesetzt werden, um die Mischung zu verhindern, vor der Verwendung Verfestigen. Trypsin-Lösung sollte auch halten gekühlt werden, bis sie benötigt werden; alternativ kann Trypsin von -20 ° C Lagerung nach Beendigung von Schritt 1.5 abgerufen werden.
3. Bereiten Sie eine Verdünnung von 01.25 Proteinmischung: DMEM (ohne Zusatz von Serum, gekühlt). Übertragen geeigneten Volumen Proteinmischung / DMEM auf jede Platte vorbereitet. Für 35 mm Glasbodenplatten, fügen Sie etwa 200 ul voll Kreis inneren Glas auf der Unterseite der Platte abzudecken.
4. Lassen Platten für mindestens 30 min in der Sicherheitswerkbank und bei RT zu sitzen. Warmen DMEM mit 10% NCS bis 37 ° C in einem Wasserbad während dieser Zeitperiode.
5. Warm Trypsin in Wasserbad auf 37 ° C unmittelbar vor der nächsten Schritte.
6. Entfernen DMEM, die derzeit in Kulturkolben mit einer Glaspipette und abgesaugt werden. Waschboden des Kolbens mit warmem sterilem PBS verbleibenden DMEM Rückstände zu entfernen.
7. Vertreiben zuvor kultivierten glatten Muskelzellen aus Flaschenboden:
   HINWEIS: Flasche wurde festgestellt Tage zu diesem Schritt Zellen zu ermöglichen Vorbereitung zu erreichen gewünschten Konfluenz (ca. 80%) vor Platte. Die Zellen wurden in dem Kolben in 20 ml DMEM mit 10% NCS und inkubiert bei 37 ° C mit 5% CO ₂ -Zufuhr 24 h ursprünglich suspendiert, wonach DMEM Versorgungs aktualisiert wurde , und die Zellen zurückgegeben wurden Inkubator. DMEM wurde aktualisiert Vorabendry 48 Stunden nach diesen ersten Schritten, bis die Zellen Konfluenz erreichten.
   1. Waschflasche schnell mit 1 ml Trypsin und dann 1 ml Trypsin entfernen Saugwirkung verwendet wird.
   2. Fügen Sie in weiteren 1 ml Trypsin und lassen für längere Zeit (ca. 30-60 sec), Kolben swishing das Enzym in Kontakt mit dem gesamten Boden des Kolbens zu gewährleisten.
   3. Beobachten Sie, wie viel Zellen unter einem Mikroskop abgelöst, bis sie mit der Trennung von Kolben zufrieden. Alternative Rascheln Trypsin-Lösung und die Kontrolle Zellablösung, bis zufrieden mit Anteil von Zellen aus Kolben getrennt.
      HINWEIS: Der Kolben kann für etwa 30-60 Sekunden in den Inkubator zurückgegeben werden, diesen Prozess zu beschleunigen, bei 37 ° C.
   4. Sobald Zellen unter Verwendung von Trypsin abgelöst wurden, fügen Sie frisches DMEM mit 10% NCS in den Kolben die Trypsin Reaktion zu stoppen (ausreichendes Volumen , so dass Trypsin ^1/8 des Gesamtvolumens in Kolben bildet).
      HINWEIS: Wenn beispielsweise ein 250-ml-Kulturkolben verwendet, würde dieswerden 7 ml DMEM auf die 1 ml Trypsin in 8 ml Zelllösung zu ergeben zugegeben.
8. Transfer resultierende Zell Lösung aus dem Kolben zu einem sauberen (labeled) 50 ml konischen Röhrchen.
9. 1 ml frischem DMEM plus 10% NCS auf jeder Platte vorbereitet (ausreichend Medium 24 Stunden dauern).
10. Vorsichtig umdrehen jedes Pellet mehrere Male Zelllösung zu brechen Röhre enthält, die sich gebildet haben können.
11. Pipette Volumen sanft gemischten Zelllösung in jede Platte gewünscht.
    HINWEIS: Die empfohlene SMCs Nummer für dieses Protokoll überzogen ist 0,5-0,8 x 10 ⁶ pro 35 mm Kulturschalen. Diese Zahlen können variieren vom Zelltyp abhängig und sollten von jedem Labor getestet und modifiziert werden.
12. Schwenken Sie die Platte gründlich rechts / links gleichmäßige Verteilung der Zellen über Glasboden zu gewährleisten.

2. Transiente Transfektion mit adenoviraler Vektor , der D1SR Ca ²⁺ Indicator

1. Nach der Zugabe von mirdium und Zelllösung zu jeder Platte, lassen Platten bei 37 ° C mit 5% CO ₂ Versorgung für mindestens 1 Stunde inkubieren Zellen zu ermöglichen richtig Glas auf der Unterseite der Teller zu befestigen. Überprüfen Platten unter einem Mikroskop bei 15-Minuten-Intervallen, bis die Zellen gut befestigt sind.
2. Abrufen Adenovirus-D1SR aliquoten von -80 ° C Lagerung und halten in der mobilen Eisbad auf biologischen Sicherheitsschrank zu transportieren.
3. Pipette gewünschte Dosis (Multiplizität der Infektion von 100) von gekühlter D1SR zu jeder Platte.
   HINWEIS: Die Berechnung für das Volumen der adenoviralen Lösung pro Platte erforderlich ist, hängt von der Virustiter in der ursprünglichen Vorratslösung, die als plaquebildenden Einheit (PFU) dargestellt wird. Basierend auf unserer Erfahrung empfehlen wir eine Vielzahl der Infektion (MOI) von 100, die als die Anzahl oder Viruspartikel interpretiert wird benötigt, um eine glatte Muskelzelle (SMC) in der Kulturplatte zu infizieren.
4. Inkubieren der infizierten Zellen bei 37 ° C mit 5% CO ₂ -Zufuhr O / N.
5. Am nächsten Tag wieder aufzufüllen Zellen mit 1 ml frischem DMEM plus 10% NCS.
6. Inkubieren Platten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C in 5% CO ₂ O / N.

3. Messung der SR Luminal Ca ²⁺ Mit FRET-basierten konfokale Imaging

1. O / N Inkubation Nach Entfernen des Kulturmediums von der Platte.
2. Waschen der Kulturplatte mit 1 ml warmen physiologischen HEPES-PSS - Puffer , enthaltend (in mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, Glucose 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl ₂ 1,5 und MgCl ₂ 1 (pH 7,4) dreimal.
3. 1 ml frisches, warmes HEPES-PSS Puffer unmittelbar vor dem Beginn der Aufzeichnung.
4. Mit den ersten Bildgebung der FRET SE (sensibilisierten Emission) Anwendung (oder eine ähnliche Funktion) auf der konfokalen Mikroskops zugehörigen Software.
   1. Sobald Anwendung geöffnet ist, klicken Sie in das Register "Einstellungen" Einstellungen anpassen gewünschten experimentellen Bedingungen zu erreichen.
   <li> Manuelle Kanaleinstellungen ändern, so dass die Zellen in der Folge bei 440 nm (für den Spender und FRET-Kanäle) angeregt werden und 513 nm (für den Akzeptor-Kanal). Sammeln Sie die Emissionswellenlängen bei 488 nm (für Spender) und 535 nm (für FRET und Akzeptor).
   2. Eingestellt, die Intensität von Licht bei 15% Transmission bei 150 ms Anregungsbelichtungszeit von Zellen (Aufzeichnungszeit für drei sequentiellen GFP-Donor, FRET und YFP-Akzeptor-Kanäle) und 10 sec Intervallen zwischen den Belichtungen.
5. Stabilisiert Platte auf dem Mikroskoptisch.
6. Verwenden Sie die "Live" Taste Bildauflösung zu überprüfen. Tweak-Einstellungen weiter, bis die gewünschte Auflösung erreicht ist.
7. Noch unter der Registerkarte "Setup", um ein Bild der Probe nehmen Sie die "Bild aufnehmen" Taste.
8. Bewegen Sie sich auf die "Auswertung" Registerkarte, wählen Sie die entsprechende Methode die FRET-Effizienzen für die Experimente zur Berechnung getan. Methode 3, mit der Ratiometrisch Berechnung [E _A (i) = B / A] Wird für Experimente empfohlen Chamäleons wie die D1SR Indikator beteiligt sind.
9. Umschalten auf den "Graph" Registerkarte können die Intensitätswerte aufgezeichnet in graphischer Form während des Experiments zu beobachten.
10. Zeichnen Sie einen ROI im Bildbetrachter die entsprechende mittlere Intensität dieser Bereich von Interesse in der Grafik als Experiment weiter zu beobachten.
    HINWEIS: Ermittler können auch wählen, mehrere ROIs zu ziehen und haben Intensitäten aufgezeichnet werden entsprechend und gleichzeitig auf dem Graphen angezeigt. Alternativ können die Ermittler einen einzelnen ROI für die erste Aufnahme umreißen, und fahren Sie durch das Öffnen des Experiments auf einer Datenanalyse orientierte Version der Software mehrere ROIs zu einem späteren Zeitpunkt zu skizzieren.
    HINWEIS: Weitere Einzelheiten über die Schritte, die erforderlich FRET-Experimente zur Einrichtung kann in FRET Anwendungs-Assistent-Handbüchern. Wenn das Mikroskop nicht mit dem FRET-Assistenten, das folgende Protokoll ausgestattet ist, verwendet werden, um die Parameter ein fürAufnahme manuell.
11. Starten Sie die Aufnahme und die Datenerfassung ermöglichen mindestens 3 min eine stetige basalen Aufzeichnung des Signals auf die Einführung des Mittels von Interesse vor zu gewährleisten.
12. Einführung Ca ²⁺ -moving Mittel (zB 2 uM Thapsigargin; 100 nm Endothelin-1) als Werkzeug zur Abreicherung SR Ca ^2+, indem Sie manuell die vorbestimmte Dosis Pipettieren direkt in die Platte an einer Stelle , als in der Nähe der Region von Interesse sind wie möglich erfasst. Weiter für eine gewünschte Zeit nach der Behandlung der Aufnahme.
13. Capture-ratiometrisches FRET serielle Bilder (512 x 512 Pixel) mit einem 63X Ölimmersionsobjektiv des konfokalen inverses Mikroskop die FRET SE Anwendung.
14. Sammeln Sie Daten aus Bildgebung aus einem Cluster von 5-10 SMCs in jeder Region von Interesse (ROI) und anschließend formatieren und zu analysieren Statistiken basierte Software.
    1. Um Daten für eine spätere Verwendung zu speichern, Rechtsklick auf die aufgezeichneten Spur über und wählen Sie die Option "Export" zu Save die Tabelle mit aufgezeichneten mittleren Signalintensitäten auf dem gewählten Laufwerk des Forschers.
    2. Normalisieren von Daten von jedem einzelnen Experiment, indem jeder Datenpunkt durch die Startintensitätswert dividiert zum Zeitpunkt 0 sec beobachtet.
    3. Import normalisierte Daten aus Kalkulationstabellen in einem Statistikprogramm Projektdatei durch manuelles Kopieren und Einfügen relevanten Datenzeilen aus ihrem ursprünglichen Tabellen / sec.
    4. Automatische Graphen erzeugen, um den Datensätzen entsprechen, in das Programm eingefügt.
       Hinweis: Die Standardprogrammeinstellungen erzeugen Liniendiagramme aus importierten Daten. Diagrammtyp angezeigt wird, kann durch Klicken auf den "Wählen Sie eine andere Art von Graph" Taste unter dem "Change" geändert werden, in der Hauptwerkzeugleiste Position.
    5. Pool Daten mehrere unabhängige Studien innerhalb einer größeren Gruppe von identischen Experimenten in einem einzigen Datenblatt repräsentieren eine durchschnittliche Spur für den spezifischen Test durchgeführt, zu erzeugen.
4. Vorbereitung der cytoplasmatischen Ca ²⁺ Indicator
1. Man löst 0,0125 g Pluronic Säure (PA) in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer schwarzen Mikrozentrifugenröhrchen (kann das Rohr in mobilen Wasserbad erwärmen PA zu helfen aufzulösen).
2. Abrufen einer Röhre (50 ug) des cytoplasmatischen Ca ²⁺ Indikatorfarbstoffs (Fluo-4 AM) von -20 ° C der Lagerung.
3. Wickeln Sie das Rohr an Farbstoff in der Folie, um es zu schützen, so viel wie möglich von dem Kontakt mit Licht.
4. Pipette 45 ul der DMSO + PA-Lösung in das Rohr, den Farbstoff enthält. Wickeln DMSO + PA-Lösung in Folie und lagern bei RT.
5. Mischungs Inhalt des Röhrchens gründlich durch Lösungspolymerisation bis Pipettieren und unten mehrere Male. Alternativ beschallen für 10 min die Färbehülse.
   HINWEIS: Jede Methode gründlich den Farbstoff in der gesamten DMSO + PA-Lösung verteilt wird ausreichen, um; es ist einfach eine Frage der Präferenz des Prüfers. Wenn Ermittler Lösung zu beschallen wählt es,sollte in einem isolierten Bereich / Raum durchgeführt werden, wo andere werden durch den Lärm nicht betroffen. Forscher sollten auch schwere Schalldämpfer benutzen Ohren zu schützen.
   1. Wenn Lösung Beschallen, legen Folienwickelrohr der Farbstoff in einem Schaumrohrhalter und Platz im Inneren des 2/3 voll (mit dH ₂ O) Ultraschallbad enthält.
   2. Platz Ultraschallbad in isolierten Bereich / Raum und Energie Maschine (Kopfschutz gewährleisten ist an Ort und Stelle vor dem Beschallen Prozess initiieren). Lassen Sie Platz und lassen Sie Maschine für 10 Minuten laufen, bevor sie ab und das Abrufen der Röhre herunter (halten in Folie verpackt vor Licht zu schützen, so lange wie möglich).
6. Aliquot der jetzt gründlich gemischte Lösung in dunklen Mikrozentrifugenröhrchen (5 ul pro Röhrchen, sollte in der Lage sein, 10 Röhren insgesamt zu machen).
7. Wickeln Sie jeden aliquoten Rohr in Folie. Beschriften Sie die Röhrchen und lagern in Trocken bei -20 ° C Bedingungen bis zur Verwendung.

5. Messung der cytoplasmatischen Ca ²⁺

1. Führen Sie die Schritte in 1,1-1,12 auf Kulturplatten von Rattenaorta SMCs vorzubereiten.
2. Entfernen Sie das Kulturmedium von der Platte bei 48 Stunden nach der Kultur.
3. Entfernen der zuvor hergestellten Aliquot von cytoplasmatischen Ca ²⁺ Anzeige (5 ul) von -20 ° C Lagerung und Aufrechterhaltung in mobilen Eisbad bis zur Verwendung.
4. Waschen der Kulturplatte mit 1 ml warmen physiologischen HEPES-PSS - Puffer , enthaltend (in mmol·L ^{- 1)} NaCl 140, Glucose 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl ₂ 1,5 und MgCl ₂ 1 (pH 7,4) dreimal.
5. Mischen Sie die Anzeige mit 1 ml warmem HEPES-PSS und laden Sie es auf die Kulturplatte.
6. Inkubieren SMCs mit dem Indikator für 1 h bei RT (24 ° C).
7. Entfernen Sie Anzeige von Kulturplatte und wasche mit 1 ml warmer physiologischer HEPES-PSS-Puffer dreimal.
8. 1 ml frisches, warmes HEPES-PSS Puffer unmittelbar vor dem Beginn der Aufzeichnung.
9. Erfassen Sie serielle Bilder (512 x 512 Pixel) mit einem 63X oil-Tauchziel des konfokalen inversen Mikroskop.
   1. Manuelle Einstellungen zu ändern, so dass die Zellen bei 488 nm angeregt, und die Emissionswellenlängen bei 555 nm mit einer Abtastgeschwindigkeit von 700 Hz gesammelt.
   2. Eingestellt, die Intensität von Licht bei 15% Transmission bei 150 msec Anregungsbelichtungszeit von Zellen (die Zeit, die die Zellen gegenüber Licht zu bestimmten Zeitintervallen während der Aufzeichnung ausgesetzt sind) und 5 sec Intervallen zwischen den Belichtungen.
10. Stabilisiert Platte auf dem Mikroskoptisch und starten Sie die Aufnahme.
11. Nehmen Sie für mindestens 3 min eine stetige basalen Aufzeichnung des Signals vor der Einführung des Mittels von Interesse zu gewährleisten.
12. Einführung Ca ²⁺ -moving Mittel (zB 2 uM Thapsigargin) als Werkzeug zur Abreicherung SR Ca ²⁺ (wie in Schritt 3.16 beschrieben) und weiterhin für die gewünschte Menge an Zeit , nach der Behandlung der Aufnahme.
13. Nehmen Sie die Signalintensität mit Mikroskop spezifische Software durch Fluoreszenz si durchschnittlichgnale (F / F ₀₎ aus einem Cluster von 5-10 SMCs in jeder Region von Interesse (ROI). Sammeln, das Format und analysieren Daten aus Bilddaten-Analyse-Software. Siehe Schritte 3.18.1-3.18.5 für die Beschreibung der Datenerhebung und Analyse dieser Software.

Representative Results

In diesem Abschnitt werden Beispiele für die Ergebnisse , die unter Verwendung der beschriebenen Verfahren erhalten werden kann , SR luminalen Ca ²⁺ -Konzentration Daten zu erfassen, im Vergleich zu der üblicherweise verwendeten Art indirekt Änderungen Messung Ca ²⁺ store Konzentrationen Organell durch Schwankungen in cytoplasmatischen Ca ²⁺ beobachtet .

1A zeigt eine Momentaufnahme einer Region of Interest (ROI) der SMC Kultur transfiziert mit D1SR Adenovirus in der YFP - Kanal (514 nm Anregung / 535 nm Emission). Wie es gezeigt ist , obwohl alle SMCs positiv für D1SR Expression sind, ist es offensichtlich , dass die Expressionsniveaus für D1SR Indikator zwischen verschiedenen Zellen innerhalb des gleichen ROI variieren. 1B zeigt ein 2-D - Projektion eines Fluoreszenzbildes einer SMC mit dem D1SR transfiziert Adenovirus (YFP - Kanal), die ein klares Bild von Ca ²⁺ Verteilung präsentiertinnerhalb der expansiven SR Luminal - Netzwerk. 1C stellt D1SR Indikator Verteilung in der SMC mit GFP (440/488 nm), FRET (440/535 nm) und YFP (514/535 nm) Bandpassfilter.

Wir zeigen auch Beispiele für die Ca ²⁺ Signalspuren aus der Überwachung der Bewegung dieses gezielte Ion in der SR erhalten, die klare Prüfung der akuten Exposition von Zellen mit zu einem SR - Entleerungsmittel Thapsigargin (2 uM) (Abbildung 2). Wie in 2A und 2B gezeigt ist , induziert Thapsigargin einen Abfall SR Ca ²⁺ -Gehalt ([Ca ^2+] _SR).

In 3A haben wir repräsentative Bilder von kultivierten SMCs mit der cytoplasmatischen Ca ²⁺ Indikator mit dem SR Entleerungsmittel Thapsigargin (2 uM) behandelt geladen gezeigt. Die beobachtete vorübergehende Spitze in der aufgezeichneten Ca ²⁺ -Signal ( 2+ -Freisetzung in das Zytoplasma der SMC, selbst wenn die Quelle der Transienten Ca ²⁺ nicht explizit identifiziert werden.

4A zeigt repräsentative Schnappschüssen von kultivierten SMCs Expression des SR - Calciumindikator D1SR und mit 100 nm von Endothelin-1. Wie in beiden Figuren 4A und 4B gezeigt ist , induziert Endothelin-1 einen langsamen, aber stetigen Rückgang der SR - Calciumgehalt wie in D1SR FRET - Signal durch einen Tropfen gemessen. Wie ersichtlich, erlaubt die ratiometrisch FRET - Protokoll wichtiger Untersuchung von Ca ²⁺ Bewegungen direkt auf die Wirkungsweise des Mittels bezogen verwendet. Diese Ionenbewegung in / aus dem größten Ca ²⁺ Store in der Zelle auf diese Weise direkt zu messen ist hilfreich bei der Ergebnisse repräsentativ für Ca ²⁺ Dynamik direkt im Zusammenhang mit der SR Handlungen oder aufgrund einer Änderung Bereitstellung s in SR Lumen Umgebung.

Abbildung 1. Verteilung des SR Ca ²⁺ Indikator D1SR in Rattenaorta SMCs. (A) Repräsentative Bild , das SMC Kultur transfiziert mit D1SR andenoviral Vektor bei 48 Stunden nach der Infektion. (B) 2-D - Projektion eines Fluoreszenzbild D1SR Verteilung in einer kultivierten SMC unter Verwendung YFP Kanal (514 nm Anregung / 535 nm Emission). (C) Repräsentative Momentaufnahme einer SMC transfiziert mit D1SR Indikator GFP (440/488 nm), FRET (440/535 nm) und YFP (514/535 nm) Bandpassfilter. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Thapsigargin führt zu einem deutlichen Rückgang der [Ca ^2+] _SR. (A) in Echtzeit Pseudo Snapshots (FRET - Kanal) von kultivierten Ratten - Aorten - SMCs mit D1SR transfiziert und mit 2 uM Thapsigargin eine Abnahme der Signalintensität zeigt , angibt , ein deutlicher Rückgang der SR Ca ²⁺ -Gehalt aufgrund Thapsigargin-induzierte Ca ²⁺ Freisetzung. (B) Repräsentative Spur für F / F ₀ Wert in kultivierten SMCs behandelt mit 2 uM Thapsigargin einen deutlichen Rückgang bei der Bestätigung [Ca ^2+] _SR. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

FiAbbildung 3. Thapsigargin bewirkt eine signifikante Erhöhung der cytoplasmatischen Ca ²⁺ ([Ca ^2+] _i). (A) Repräsentative Schnappschüsse von kultivierten Ratten - Aorten - SMCs beladen mit cytoplasmatischen Ca ²⁺ Indikator, und mit 2 uM Thapsigargin. Wie gezeigt, bewirkt Thapsigargin eine signifikante Erhöhung der Signalintensität im Zytoplasma aufgrund der Freisetzung von Ca ²⁺ aus dem SR. (B) Repräsentative Spur für F / F ₀ Wert in kultivierten SMCs behandelt mit 2 uM Thapsigargin. Die dargestellte Zunahme der Ca ²⁺ Signal wird als auf die Menge an Ca proportional zu ²⁺ aus der SR veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Endothelin-1 führt zu einem deutlichen Rückgang der [Ca ^2+] _SR. (A) in Echtzeit Pseudo Snapshots (FRET - Kanal) von kultivierten Ratten - Aorten - SMCs mit D1SR transfiziert und mit 100 nm Endothelin-1 eine langsame zeigt aber stetigen Abnahme des Intensitätssignal einen deutlichen Rückgang bei SR Ca ²⁺ -Gehalt aufgrund Endothelin-induzierten Ca ²⁺ Freisetzung für den SR angibt. (B) Repräsentative Spur für F / F ₀ Wert in kultivierten SMCs mit 100 nm von Endothelin-1 behandelt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Transfektion von VSMCs mit dem D1SR Adenovirus Ca ²⁺ -Konzentrationen in dem Lumen des SR zu studieren. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Messung von Ca ²⁺ in diesem Organell sowie seine Bewegung in den / aus dem SR als Ergebnis der Anwendung von unterschiedlichen Calcium bewegenden Agenten. Diese Methode hat viele Vorteile für die Forscher arbeiten an einem umfassenden Verständnis der Auswirkungen von Änderungen an SR und cytoplasmatischen Ca ²⁺ Spiegel beeinflussen Gesamtzellgesundheit und wie diese Veränderungen sind miteinander verbunden. Traditionelle Beobachtung von intrazellulären Ca ²⁺ Bewegung beinhaltet die Verfolgung von Änderungen nur cytoplasmatischen Ca ²⁺ -Spiegel. Ein wichtiger Vorteil abgeleitet von der D1SR oder ähnliche Konstrukte verwenden, daher ist die Fähigkeit, diese Ionen-Bewegung zu überwachen, um eine spezifische Organell Beteiligung wie der SR, anstatt sich auf die Wirkung von Agonisten vague Rückschlüsse auf die SR zu ziehen, die durchindirekt beobachtet Änderungen an cytoplasmatischen Ca ²⁺ -Spiegel durch eine solche Manipulation induziert. Entlang der gleichen Ader , die Mittel dazu dienen, beeinflussen SR Ca ²⁺ gezielt mehr effizient genutzt , um ihre Auswirkungen auf sowohl Organell und zellweite zelluläre Ca ²⁺ Konzentrationen und die allgemeine Gesundheit zu bewerten. Es ist aufgrund dieser Vorteile , dass die Transfektion kultivierter Zellen mit D1SR ein direkteres, sowie kostenlose, Verfahren zur Messung von Änderungen in intraluminalen SR Ca ²⁺ -Spiegel bietet. Ebenfalls von Bedeutung ist die Tatsache , dass dieses Modell ein Werkzeug zum Messen von Änderungen in Ca ²⁺ -Konzentration sorgt innerhalb des SR - Netzwerk in Reaktion auf pharmakologische oder physiologische Mittel , die bekannt sind , Zellstress oder spezifischen funktionellen Antworten zu induzieren. Dies wird möglich, indem eine Kalibrierungskurve für D1SR Indikator in jeder Zelle von Interesse zu erzeugen. Calcium - Konzentration im ER / SR kann dann durch die Kalibrierung normalisierte D1SR Verhältnis (F / F ₀ berechnet werden) Gegen die Standard - Kalibrierungskurve , wie zuvor ^{10, 11} beschrieben.

Eine Einschränkung des hier skizzierten Protokoll ist der Mangel an Informationen über die Verwendung des D1SR Konstrukt in anderen Zelltypen. Diese Methode hat sich bisher als erfolgreich erwiesen für Ratten - SMCs in unseren Studien mehrfach ^13-15, obwohl seine Verwendung mit anderen Zelltypen hat begrenzte bisher gewesen. Für den Erfolg dieses Verfahrens ist es wichtig, dass alle Vorsichtsmaßnahmen, die gesunde Progression der Zellkulturschritte, um sicherzustellen, getroffen werden. Daher ist es wichtig, ein geeignetes Material ermöglicht das Zellwachstum auf Platten, wie die vielen Proteinbasis gelatinöse Stoffe zum Kauf angeboten zu verwenden, die bewiesen haben, ein ausreichendes Wachstum von Rattenaorta SMCs auf Glasboden-Mikroskopie Platten zu fördern. Variability in den Erfolg der Transfektion mit D1SR und nachfolgende Abbildungs ​​kann beobachtet werden, wenn die Zellen nicht während ihrer optimalen Durchgänge und bei hohen Konfluenz hergestellt. Änderungen an phenotype inhärent verlängerte Verwendung der gleichen Zelllinie kann zu suboptimalen Transfektion und schwaches Signal während der Abbildungsstufe erhalten wird. Die Einschränkungen bei der Verwendung dieses Verfahrens impliziert sind daher vor allem solche unvermeidlich durch die erforderliche Zellkulturarbeiten vorgenommen, wie Versuche das D1SR Konstrukt muss für mindestens 36-48 h vor ihrer Ausführung Konfluenz der Zellen für die Bildgebung zu gewährleisten, hergestellt werden, und eine ausreichende Zeit zur Inkubation von Zellen mit dem Adenovirus wächst.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.