Mätning av kalcium Fluktuationer Inom sarkoplasmatiska retiklet av odlade glatta muskelceller Använda FRET-baserade Confocal avbildning

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

Ca2 ⁺ är en mycket viktig jon finns i överflöd inom varje enskild cell i kroppen. Det har viktiga roller i många olika cellfunktioner, inklusive tillväxt, proliferation, migration och apoptos ^1-4. Det är väl etablerat att Ca2 ⁺ kan påverka dessa processer genom både direkta och indirekta åtgärder, och därför ändras till den normala intracellulära koncentrationen av denna jon kan lätt leda till negativa konsekvenser för drabbade celler. SR anses vara den största intracellulära Ca2 ⁺ butik i cellen ^5. Steady state-nivåer av Ca2 ⁺ i både SR och cytoplasman normalt upprätthålls genom konstant flöde in i och ut ur Ca2 ⁺ -transporting kanaler i denna organell. Stressiga förhållanden åläggs celler på grund av någon form av skada eller sjukdom i allmänhet förknippas med betydande förändringar i SR Ca ^{2 +} som går på att ha långvariga effekter på hanALTH av cellen. I de svåraste fallen, oförmågan av en stressad cell återhämta sig och bibehålla steady state SR Ca2 ⁺ nivåer kan även kulminera i döden genom apoptos ^6-8.

Aktuell forskning om cellulära Ca2 ⁺ dynamik begränsas av det faktum att några studier testet organell Ca2 ⁺ lagra innehåll direkt ^9-11. Den vanligaste praxis innebär istället mätning av cytoplasmiska Ca ^{2 +} nivåer som indirekta mätningar av förändringar i SR Ca ^{2 +} innehåll ^12-14. I dessa experiment är Ca2 ⁺ vanligt förmås att frigöras från SR genom användning av farmakologiska medel som orsakar organell är utarmning (t.ex. tapsigargin). Slutsatser dras sedan med avseende på förändringar i SR Ca ^{2 +} baserat på fluktuationer i cytoplasmiska Ca ^{2 +} koncentrationer. Trots möjligheten som återstår för utredarna att dra sådana slutsatser i en rondell manner, är denna metod för SR Ca ^{2 +} mätningen klart ett indirekt sätt att få fram sådan information, med många begränsningar om tolkningen av insamlade data. För att kringgå detta tydlig begränsning, är det nödvändigt att mäta mängden av Ca2 ⁺ hittades direkt i SR luminala nätverket.

Vital till det slutliga resultatet av att kunna spela in direkt intraluminala SR Ca ^{2 +} nivåer är cellodlings verktyg och Ca2 ⁺ indikator. För de data som refereras i den aktuella manuskriptet, är det viktigt att notera att VSMC användes kom från en frusen cellinje. Celler odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) + 10% serum från nyfödd kalv (NCS) över passager 22-26 för de beskrivna experimenten, inkuberades vid en konstant 37 ° C med 5% _CO2 försörjningen. Med användning av den aktuella metoden, till exempel, celler har mycket framgångsrikt odlas på en proteinblandning som simulerar den extracelluläramiljö med många olika typer av vävnad ^15. Viktigt för framgång längs venen av SR Ca ^{2 +} forskning är den typ av proteinblandning som används; i det här fallet var en låg tillväxtfaktor mängd nödvändig för att undvika komponenter i det här verktyget från att påverka den vanliga Ca2 ⁺ signalering och rörelser som förekommer ständigt inom de testade cellerna. Efter framgångsrik tillväxt av testceller, Ca ^{2 +} indikator måste också effektivt införas för att dessa odlade celler. Detta har blivit möjligt genom att använda en adenovirusvektor som bär SR-bor Ca ^{2 +} indikator D1SR. Att uppnå en hög transfektionseffektivitet, måste cellerna inkuberas med virala vektorer under minst 36 till 48 h före avbildning. Denna beredning ger ett pålitligt verktyg för att mäta Ca ^{2 +} transienter inom SR lumen med hög noggrannhet och reproducerbarhet.

D1SR indikator som används i detta protokoll är en modifierad variant av D1ER Ca2 ⁺ indicator som ursprungligen skapades av Dr Roger Tsien laboratorium vid University of California, San Diego, USA ^9,16. Den ursprungliga D1ER tillhör en andra generation av genetiskt kodade Ca2 ⁺ indikatorer kallas cameleons som visar Ca2 ⁺ känsligheter över ett mycket bredare spektrum (0,5-160 pM) jämfört med tidigare Ca2 ⁺ indikatorer ^9,16. Den nya varianten D1SR, en slags gåva från Dr. Wayne Chen (University of Alberta, Kanada), men bär en mutant calsequestrin sekvens (i stället för en kalretikulin sekvens som i den ursprungliga D1ER). Mutanten calsequestrin har en reducerad bindning till Ca2 ⁺ som eliminerar problemet att konkurrera med endogen calsequestrin i bindning till Ca ^{2 +} i SR lumen ^11. Den D1SR Indikatorn bär en stympad förbättrad cyan fluorescerande protein (GFP) och den gula fluorescerande protein (YFP) som binder genom en länkprotein innehållande modifierad calmodulin (CAM) och M13 (than 26-rest-peptid av myosin lätta kedjan kinas som binder till CAM) sekvenser. Cam-M13-sekvensen har modifierats för att förhindra M13 från att binda till endogen kalmodulin. Dessutom, för att säkerställa SR retention, en calsequestrin sekvens har lagts på 5'-änden av GFP ^11. När den är bunden till Ca ^2+, går CaM-M13-domänen genom konformationsförändringar som resulterar i en ökning av energiöverföringen mellan den flankerande GFP och YFP, som registreras som en ökning i FRET signalintensitet. Å andra sidan, när koncentrationen av SR luminal Ca ^{2 +} droppar, går CaM-M13-domänen genom omvända konformationsförändringar, vilket resulterar i en minskning av energiöverföringen mellan den flankerande GFP och YFP, och en betydande nedgång i FRET signalintensitet .

Protocol

Etik uttalande: Alla experiment och förfaranden genomfördes i samförstånd med Laboratory Biosafety riktlinjer University of British Columbia, Vancouver, Kanada. 1. Framställning av 35 mm glasbotten odlingsskålar för FRET-baserade konfokalmikroskopi Förbereda plattor med användning av följande procedur 36-48 h före experiment. Hämta valt geléform proteinblandning och 0,25% trypsin-EDTA från -20 ° C lagring och hålla dem i mobil isbad fram till användning. OBS: Beläggn…

Representative Results

I detta avsnitt ges exempel på resultat som kan uppnås med hjälp av den beskrivna metoden för att fånga SR luminala Ca2 + koncentrationsdata, jämfört med vanligtvis används sättet för indirekt mätning av ändringar i organell Ca2 + butikskoncentrationer genom att observera variationer i cytoplasma Ca2 + . Figur 1A visar en ögonblicksbild av ett område av intresse (…

Discussion

Detta protokoll beskriver transfektion av VSMC med D1SR adenovirus att studera Ca2 ⁺ koncentrationer inom lumen av SR. Denna metod gör det möjligt att direkt mätning av Ca2 ⁺ i denna organell samt dess rörelse in / ut ur SR som ett resultat av tillämpningen av olika kalcium rörliga medel. Denna metod har många fördelar för utredare som arbetar mot en omfattande förståelse av hur förändringar i SR och cytoplasmiska Ca ^{2 +} nivåer påverka den totala cellulär hälsa och hur d…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.