מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

Ca ^{2 +} הוא יון חשוב מאוד למצוא למכביר בתוך כל תא ותא בגוף. יש לו תפקידים משמעותיים רבים תפקודים תאיים שונים, לרבות גידול, התפשטות, הגירה, ו אפופטוזיס ^1-4. היא מבוססת היטב כי Ca ^{2 +} יכול להשפיע על תהליכים אלה הם באמצעות פעולות ישירות ועקיפות, ולכן, שינויים לריכוז הנורמלי התאי של יון זה יכול לגרום בקלות תוצאות שליליות עבור תאים חולים. ערך SR נחשב החנות הגדולה התאי Ca ^{2 +} בתוך התא ^5. רמות מצב יציב של Ca ²⁺ הן SR ו הציטופלסמה נשמרות בדרך כלל באמצעות זרימה מתמדת לתוך ומתוך ערוצי -transporting Ca ²⁺ של אברון זה. התנאים המלחיצים המוטלים תאים בשל כל צורה של פציעה או מחלה הם נפוצים הקשורים שינויים משמעותיים SR Ca ^{2 +} כי להמשיך להיות השפעות ארוכות טווח על שהואalth של התא. בשנת הקשה ביותר של המקרים, את חוסר היכולת של תא הדגיש להתאושש ולשמור Ca SR מצב יציב ²⁺ רמות אולי אפילו לשיאה למוות על ידי אפופטוזיס ^6-8.

מחקר נוכחי לתוך דינמיקת הסלולר Ca ²⁺ מוגבל על ידי העובדה כי בדיקת מחקרים מעטים אברון תוכן החנות ^{2 +} Ca ישירות ^9-11. המנהג הנפוץ ביותר במקום כרוך מדידת רמות ציטופלסמית Ca ^{2 +} מדידות עקיפות של שינויים בתוכן SR Ca ^{2 + 12-14.} בניסויים אלה, Ca ^{2 +} מושרת נפוצה להשתחרר מן SR באמצעות סוכנים תרופתיים גורמים הדלדול של אברון (למשל thapsigargin). מסקנות אז נמשכו לגבי שינויי SR Ca ^{2 +} ומתבססים על תנודות הריכוזים ציטופלסמית Ca ^2+. למרות היכולת הנותרים לחוקרים להסיק מסקנות כאלה בתוך ma עקיפהnner, שיטה זו של מדידת ²⁺ SR Ca היא ללא ספק דרך עקיפה כדי ללקט מידע כזה, עם מגבלות רבות בנוגע לפרשנות של הנתונים שנאספו. כדי לעקוף מגבלה ברורה זו, יש צורך למדוד את כמות Ca ^{2 +} מצאה ישירות בתוך הרשת לומינל SR.

ויטל לתוצאה הסופית של יכולת להקליט רמות Ca ²⁺ SR intraluminal ישירות הם כלי תרבית תאים ומחוון Ca ²⁺ בשימוש. עבור הנתונים הפניה בכתב היד הנוכחית, חשוב לציין כי VSMCs בשימוש בא משושלת תא קפוא. תאים היו בתרבית הבינונית של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) + 10% בת-יומה בסרום (NCS) מעל הקטעים 22-26 עבור הניסויים שתוארו, וטופח על 37 מעלות צלזיוס קבוע עם 5% CO ₂ אספקה. באמצעות השיטה הנוכחית, למשל, תאים כבר גדלו מאוד בהצלחה על תערובת חלבון המדמה את תאייםהסביבה של סוגים שונים של רקמות ^15. חשוב להצלחה לאורך הוריד של SR Ca ^{2 +} מחקר הוא סוג של תערובת חלבונים המשמשים; במקרה זה, מגוון גורם צמיחה נמוך היה נחוץ כדי למנוע מרכיבי הכלי הזה מאת משפיע על האיתות הרגילה Ca ²⁺ ותנועות המתרחשות כל זמן בתוך התאים הנבדקים. בעקבות גידול מוצלח של תאי בדיקה, מחוון Ca ²⁺ חייב גם להיות הציג ביעילות תאים בתרבית אלה. זה הפך להיות אפשרי באמצעות וקטור adenoviral שנושא את SR-המתגורר Ca ^{2 +} אינדיקטור D1SR. כדי להשיג יעילות transfection גבוהה, התאים חייבים להיות מודגרות עם וקטורים ויראליים לפחות 36-48 שעות לפני הדמיה. הכנה זו מספקת כלי אמין למדידת Ca ^{2 +} ארעיים בתוך לומן SR עם דיוק שחזור גבוה.

מחוון D1SR להשתמש בפרוטוקול זה היא גרסה שונה של D1ER Ca ^{2 +} indicator כי נוצרה במקור על ידי המעבדה של ד"ר רוג'ר צ'יין באוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו, ^9,16 ארה"ב. D1ER המקורי שייך לדור שני של אינדיקטורים מקודדים גנטי Ca ²⁺ שנקראו cameleons המציגים רגישויות ²⁺ Ca פני טווח רחב הרבה יותר (0.5-160 מיקרומטר) לעומת מדדים קודמים Ca ^{2 + 9,16.} D1SR גרסה חדשה, מתנה סוג מד"ר וויין חן (מאוניברסיטת אלברטה, קנדה), לעומת זאת, נושא רצף calsequestrin מוטציה (במקום רצף calreticulin כמו D1ER המקורי). Calsequestrin מוטציה יש מופחת מחייב Ca ^{2 +} הפותר את הבעיה של מתחרים עם calsequestrin אנדוגני מחייב Ca ^{2 +} בתוך SR לומן ^11. מחוון D1SR נושאת חלבון פלואורסצנטי ציאן משופרת קטום (CFP) ו חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כי לאגד על ידי חלבון מקשר המכיל calmodulin שונה (CAM) ו M13 (tהוא 26-שאריות פפטיד של קינאז אור-שרשרת שרירן הנקשרת רצפים CAM). רצף CAM-M13 שונה כדי למנוע M13 מלהיקשר calmodulin אנדוגני. כמו כן, על מנת להבטיח שימור SR, רצף calsequestrin נוסף על קצה 5'של CFP ^11. כאשר חייב Ca ^{2 +,} תחום CAM-M13 עובר שינויים מרחביים כי לגרום לעלייה בהעברת האנרגיה בין CFP האיגוף ו YFP, הנרשם כעלייה את עוצמת אות הסריג. מצד השני, כאשר הריכוז של SR לומינל Ca ^{2 +} טיפות, תחום CAM-M13 עובר שינויים מרחביים הפוכים, וכתוצאה מכך ירידת העברת האנרגיה בין CFP האיגוף ו YFP, וירידה משמעותית בעוצמת אות סריג .

Protocol

הצהרה אתיקה: כל הניסויים ונהלים נערכו בהסכם עם הנחיות בטיחות ביולוגית מעבדה של אוניברסיטת קולומביה הבריטית, ונקובר, קנדה. 1. הכנה 35 מ"מ תרבות מנות זכוכית תחתונות למיקרוסקופיה Confocal מבוססת סריג <li style=";text-align:right;direction:…

Representative Results

סעיף זה מספק דוגמאות של התוצאות ניתן להשיג באמצעות השיטה המתוארת ללכוד SR לומינל Ca 2+ נתוני ריכוז, בהשוואה לאופן מועסק בדרך של בעקיפין מדידת שינויי אברון ריכוזי החנות 2 + Ca ידי התבוננות תנודות ציטופלסמית Ca 2+ . <p class="jove_content" fo:keep-together.w…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את transfection של VSMCs עם אדנו D1SR ללמוד Ca ^{2 +} ריכוזים בתוך לומן של SR. שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה של Ca ^{2 +} בתוך אברון זה, כמו גם את התנועה לתוך / מתוך SR כתוצאה היישום של סוכנים שונים נע בסידן. לשיטה זו יתרונות רבים עבור חוקרים עובדים לקראת הבנה מקיפה של ?…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.