Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

Summary

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Abstract

Maintenance of steady-state calcium (Ca²⁺) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca²⁺ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca²⁺ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca²⁺-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca²⁺ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca²⁺ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca²⁺. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca²⁺ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca²⁺ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca²⁺ indicator, D1SR, is used to detect Ca²⁺ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca²⁺ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca²⁺ movement.

Introduction

^{Ca2 +} é um ião muito importante encontrada em abundância no interior de cada célula única no corpo. Ele tem papéis importantes em muitas funções celulares diferentes, incluindo o crescimento, proliferação, migração, e apoptose ^1-4. Está bem estabelecido que Ca ²⁺ pode afetar estes processos através de acções directas e indirectas, e, portanto, alterações nas concentrações intracelulares normais deste íon pode facilmente resultar em consequências negativas para as células afetadas. O SR é considerado como o maior de ^{Ca2 +} intracelular no interior da célula da loja ^5. Níveis estáveis ​​de Ca ^2+, tanto no SR e no citoplasma são normalmente mantida através de constante fluxo de entrada e saída dos Ca ²⁺ -Transporte canais dessa organela. As condições estressantes impostas células devido a qualquer tipo de lesão ou doença são comumente associados com mudanças significativas em Ca ²⁺ SR que passam a ter efeitos duradouros sobre o que eleALTH da célula. No mais severo dos casos, a incapacidade de uma célula salientou para recuperar e manter o estado estacionário SR níveis ^{de Ca2 +} podem ainda culminam na morte por apoptose ^6-8.

A pesquisa atual em celulares Ca ²⁺ dinâmica é limitada pelo fato de que poucos estudos teste organela Ca ²⁺ armazenar conteúdo diretamente ^9-11. A prática mais comum, em vez envolve a medição da citoplasmáticos níveis de Ca ²⁺ como medidas indiretas de mudanças na SR Ca ²⁺ conteúdo ^12-14. Nestas experiências, ^{Ca2 +} é normalmente induzido a ser libertado a partir da SR, através da utilização de agentes farmacológicos que causam depleção do organelo (por exemplo, tapsigargina). As conclusões são então desenhadas no que diz respeito a alterações SR Ca ²⁺ com base em flutuações nos citoplasmáticos concentrações ^{de Ca2 +.} Apesar da capacidade remanescente para os investigadores para desenhar tais conclusões em uma ma rotundaNNER, este método de SR Ca ²⁺ medida é claramente uma forma indireta para recolher essa informação, com muitas limitações relativas à interpretação dos dados coletados. A fim de contornar esta restrição clara, é necessário medir a quantidade de Ca ²⁺ encontrado diretamente na rede luminal SR.

Vital para o resultado final de ser capaz de gravar diretamente SR níveis intraluminais ^{Ca2 +} são as ferramentas de cultura celular e o indicador de ^{Ca2 +} usado. Para os dados referenciados no manuscrito actual, é importante notar que as VSMCs utilizados são provenientes de uma linha de células congelada. As células foram cultivadas em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de soro de vitelo recém-nascido (NCS) ao longo de 22-26 passagens para as experiências descritas, incubou-se a uma constante de 37 ° C com 5% de CO ₂ de alimentação. Usando o método actual, por exemplo, as células foram cultivadas com muito sucesso em uma mistura de proteína que simula o extracelularambiente de muitos tipos diferentes de tecido ^15. Importante para o sucesso ao longo da veia de Ca ²⁺ SR pesquisa é do tipo de mistura de proteína utilizada; Neste caso, uma variedade de baixo factor de crescimento foi necessário para evitar componentes desta ferramenta de afectar a sinalização ^{de Ca2 +} regular e movimentos ocorrem constantemente dentro das células testadas. Após o crescimento das células de teste bem sucedido, o indicador de ^{Ca2 +} deve também ser eficazmente introduzido para estas células em cultura. Isto tornou-se possível através da utilização de um vector adenoviral que realiza a ²⁺ D1SR indicador Ca-residente SR. Para alcançar uma elevada eficiência de transfecção, as células devem ser incubadas com vectores virais para, pelo menos, 36-48 horas antes da imagiologia. Esta preparação fornece uma ferramenta confiável para medir Ca ^{2 +} transientes dentro do lúmen SR com alta precisão e reprodutibilidade.

Indicador D1SR utilizado neste protocolo é uma variante modificada do D1ER ^{Ca2 +} indicator que foi originalmente criado pelo laboratório do Dr. Roger Tsien, da Universidade da Califórnia, San Diego, EUA ^9,16. O D1ER originais pertence a uma segunda geração de codificados geneticamente Ca ²⁺ indicadores chamados Cameleons que exibem Ca ²⁺ sensibilidades sobre uma gama muito mais ampla (0,5-160? M), em comparação com anteriores Ca ²⁺ indicadores ^9,16. O novo D1SR variante, uma simpática oferta do Dr. Wayne Chen (Universidade de Alberta, Canadá), no entanto, transporta uma sequência mutante calsequestrin (em vez de uma sequência de calreticulina como no D1ER original). O calsequestrin mutante tem uma reduzida ligação a ^{Ca2 +} que elimina o problema de competir com calsequestrin endógeno na ligação a ^{Ca2 +} dentro do lúmen ¹¹ SR. O indicador D1SR carrega uma proteína fluorescente truncada reforçada ciano (PCP) e proteína amarela fluorescente (YFP) que se ligam por uma proteína ligante contendo calmodulina modificado (CAM) e M13 (tele péptido 26-resíduo de miosina-quinase de cadeia leve que se liga a) sequências de came. A sequência de CaM-M13 foi modificado para evitar M13 de ligação a calmodulina endógena. Além disso, para assegurar a retenção de SR, uma sequência calsequestrin foi adicionado na extremidade 5 'de PCP ^11. Quando ligado ao ^{Ca2 +,} o domínio CAM-M13 passa por mudanças conformacionais que resultam num aumento na transferência de energia entre o PCP de flanqueamento e YFP, que é registado como um aumento na intensidade do sinal de FRET. Por outro lado, quando a concentração de SR Ca ²⁺ luminal diminui, o domínio CAM-M13 passa por mudanças conformacionais reversa, resultando numa diminuição na transferência de energia entre o PCP de flanqueamento e YFP, e uma queda significativa na intensidade do sinal de FRET .

Protocol

declaração de ética: Todos os experimentos e os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes Laboratório de Biossegurança da Universidade de British Columbia, Vancouver, Canadá. 1. Preparação de 35 placas de cultura mm com fundo de vidro para sistemas baseados em FRET microscopia confocal Preparar as placas utilizando o seguinte procedimento 36-48 horas antes das experiências. Recuperar mistura gelatinosa proteína escolhida e 0,25% de tripsina-EDTA a partir de -20 ° …

Representative Results

Esta secção fornece exemplos de resultados que podem ser obtidos usando o método descrito para capturar dados de concentração de SR Ca 2+ luminais, em comparação com a forma geralmente empregues de medir indirectamente a alterações organelo Ca 2+ concentrações armazenar observando flutuações em Ca 2+ citoplasmático . A Figura 1A mostra um instantâneo de uma regi?…

Discussion

Este protocolo descreve a transfecção de VSMC com o adenovírus D1SR para estudar as concentrações ^{de Ca2 +} no interior do lúmen da SR. Este método permite a medição directa do ^{Ca2 +} neste organelo, bem como o seu movimento para dentro / para fora da SR, como resultado da aplicação de diferentes agentes de movimento de cálcio. Este método tem muitas vantagens para os investigadores que trabalham no sentido de uma compreensão abrangente de como as mudanças para o SR e citoplasmáticos …

Materials

Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate)	Life technologies	11995-065	Warm in 37°C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL	Corning	356230	Keep at -20°C until right before use
Newborn Calf Serum	Sigma-Aldrich		Keep at -20°C until right before use
35mm glass-bottomed plates	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask	BD Falcon	353136
Trypsin/EDTA Solution	Life technologies	25200056	Keep at -20°C until right before use
50 mL Polypropylene Conical Tube	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	Keep at -20°C until right before use
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.