Marginating यकृत Leukocytes के चुनिंदा कटाई

Summary

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Abstract

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Introduction

जिगर sinusoids जीव के लिए महत्वपूर्ण विभिन्न प्रतिरक्षा गतिविधियों के कई ल्युकोसैट उपप्रकार होते हैं। उदाहरण के लिए, (महाराष्ट्र) प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के.) यकृत marginating भी गड्ढे कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है, की विशेषता है आकृति विज्ञान के रूप में बड़ी बारीक लिम्फोसाइटों (LGLs) और कार्यात्मक सहज साइटोटोक्सिक क्षमता के साथ ल्यूकोसाइट्स, रक्त की स्थापना के खिलाफ यकृत-प्रतिरोध सक्रिय रूप जनित ट्यूमर मेटास्टेसिस। इस के साथ साथ प्रस्तुत विधि के लक्ष्य महाराष्ट्र ल्यूकोसाइट्स के चुनिंदा कटाई, इस महत्वपूर्ण और अद्वितीय सेल आबादी (और प्रतिरक्षा डिब्बे) का अध्ययन करने के क्रम में सक्षम करने के लिए, और इन विशिष्ट कोशिकाओं पर विभिन्न जोड़तोड़ के प्रभाव (जैसे प्रतिरक्षा सक्रियण) को स्पष्ट करने के लिए है।

प्रतिरोधक क्षमता की विफलता एक विकासशील प्राथमिक ट्यूमर को खत्म करने के बावजूद, कैंसर रोगियों और पशु मॉडल में सबूत संकेत मिलता है कि प्रतिरक्षा प्रणाली को ट्यूमर कोशिकाओं, micrometastases, और throu अवशिष्ट रोग घूम नियंत्रित कर सकते हैंजीएच सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा (सीएमआई)। हालांकि, वहाँ विवो क्षमताओं में और मनुष्यों में इन विट्रो अध्ययन में और जानवरों, जो दिखाना है कि सबसे ऑटोलॉगस ट्यूमर कोशिकाओं घूम या प्लीहा ल्यूकोसाइट्स ^1,2 द्वारा cytotoxicity लिए प्रतिरोधी रहे हैं में इन दोनों के बीच एक स्पष्ट विसंगति है। इस विसंगति के लिए जिम्मेदार माना जा सकता है, कम से कम हिस्से में, एक अलग ल्युकोसैट उप-जनसंख्या, अर्थात् marginating यकृत (sinusoids) ल्यूकोसाइट्स और सक्रिय एन.के. कोशिकाओं, अर्थात् गड्ढे कोशिकाओं ³ के अपने उप-जनसंख्या के vivo अस्तित्व के लिए। दरअसल, हमारी प्रयोगशाला से अप्रकाशित डेटा संकेत दिया कि F344 चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं syngeneic (MADB106), जो घूम और प्लीहा ल्यूकोसाइट्स के लिए प्रतिरोधी पाए गए, MH-एन.के. कोशिकाओं ⁴ से lysed थे। इस प्रकार, ट्यूमर कोशिकाओं है कि कथित तौर पर "एन.के. प्रतिरोधी" घूम ल्यूकोसाइट्स के लिए कर रहे MH-एन.के. कोशिकाओं द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। उल्लेखनीय है, चूहों में MH-एन.के. की बढ़ी गतिविधि केवल विवो प्रतिरक्षा में निम्नलिखित स्पष्ट हैउत्तेजना (जैसे पाली मैं के उपयोग के माध्यम से: सी या सीपीजी-सी) ^5।

लिवर-विशिष्ट एन.के. कोशिकाओं (MH-एन.के.) sinusoidal लुमेन के अंदर स्थित हैं, endothelial कोशिकाओं और Kupffer कोशिकाओं का पालन कर। MH-एन.के. कोशिकाओं को विशेष रूप से गोलाकार घने कणिकाओं और रॉड-कोर्ड पुटिकाओं ^6, जो बायोएक्टिव पदार्थों ^7.8 के रूप में लाइसोसोमल एंजाइमों, और perforin और granzymes के रूप में एसिड फॉस्फेट शामिल की विशेषता है। एन.के. कोशिकाओं घूम साथ तुलना में, MH-एन.के. कोशिकाओं एक उच्च संख्या और कणिकाओं और पुटिकाओं ^9-11 के आकार दिखा रहे हैं। भड़काऊ शर्तों के तहत, MH-एन.के. कोशिकाओं एन.के. कोशिकाओं घूम की तुलना में, LFA-1 ¹² की उच्च अभिव्यक्ति प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है। इस बढ़ाकर अभिव्यक्ति एक व्यवस्था है जिसके द्वारा MH-एन.के. कोशिकाओं एन.के. कोशिकाओं ^13,14 घूम की तुलना में कुछ ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ और अधिक साइटोटोक्सिक हैं गठन हो सकता है। nterestingly, इंटरल्यूकिन (IL) -2 के साथ इन विट्रो ऊष्मायन के बाद, MH-एन.के. कोशिकाओं बढ़े हुए हो, औरउनकी संख्या और कणिकाओं के आकार में वृद्धि, जो सभी के एक समर्थक फाई लिम्फोकाइन-प्रेरित हत्यारे की LE (LAK) कोशिकाओं ^{15 के} साथ संगत कर रहे हैं।

सक्रिय महाराष्ट्र ल्यूकोसाइट्स विशेष रूप से मानक जिगर ल्युकोसैट कटाई विधियों, जो पीस और ऊतकों की जैविक गिरावट के आधार पर कर रहे हैं के माध्यम से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। हमारे छिड़काव दृष्टिकोण यहाँ बताया मानक तरीकों की तुलना में दो प्रमुख फायदे हैं। सबसे पहले, छिड़काव दृष्टिकोण चुनिंदा महाराष्ट्र ल्यूकोसाइट्स फसल, अन्य जिगर डिब्बों से अन्य ल्यूकोसाइट्स द्वारा संक्रमण को रोकने। दूसरा, छिड़काव तकनीक बेहतर है, अखंडता, गतिविधि, और महाराष्ट्र ल्यूकोसाइट्स की शारीरिक परिवेश को बरकरार रखता विपरीत ऊतक प्रसंस्करण दृष्टिकोण है कि क्षति कोशिकाओं या उनकी आकृति विज्ञान में परिवर्तन, और ऊतकों को नुकसान के कारण, विभिन्न कारकों की रिहाई है कि स्पष्ट रूप से प्रतिरक्षा मिलाना प्रेरित गतिविधि।

लीवर कैंसर मेटास्टेसिस एक के लिए एक प्रमुख लक्ष्य अंग हैएन डी विभिन्न संक्रमण ^{16 के} लिए। महाराष्ट्र कोशिकाओं अद्वितीय विशेषताओं के प्रदर्शन के रूप में यह इन विकृतियों के संबंध में विभिन्न शर्तों के तहत इस विशिष्ट जनसंख्या अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, यह विभिन्न BRMs द्वारा कि प्रणालीगत प्रतिरक्षा सक्रियण नोट करने के लिए योग्य है (जैसे पाली मैं: सी या सीपीजी-सी) ल्यूकोसाइट्स ⁵ घूम से MH-ल्यूकोसाइट्स अधिक सक्रिय करने के लिए दिखाया गया है।

Protocol

आचार कथन: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं तेल अवीव विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है। 1. चूहे प्रोटोकॉल तैयारी heparinized पीबीएस (30 इका?…

Representative Results

F344 चूहों में हम पूरे जिगर सेल की आबादी का cytotoxicity जिगर ऊतक के यांत्रिक पीस निम्नलिखित MH-एनके कोशिकाओं के cytotoxicity (मजबूर जिगर छिड़काव द्वारा जिगर sinusoids से एकत्र) की तुलना में, और ल्यूकोसाइट्स घूम की cytot…

Discussion

जिगर छिड़काव के साथ साथ प्रस्तुत विधि एक चयनात्मक कटाई सक्षम बनाता है और यकृत ल्यूकोसाइट्स marginating की अनूठी जनसंख्या का अध्ययन। यकृत कोशिकाओं एन.के. भी गड्ढे ³ कोशिकाओं कहा जाता है, एक विशिष्ट एन.के. से…

Materials

Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26G
Butterfly needle	OMG		21G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp