La raccolta selettiva di Marginating-epatiche leucociti
Summary
Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.
Abstract
Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.
Introduction
I sinusoidi epatici contengono numerosi sottotipi di leucociti di varie attività immunitarie critici per l'organismo. linfociti Ad esempio, marginating epatica (MH) natural killer (NK), noto anche come celle fossa, sono caratterizzati morfologicamente come grandi granulari (LGLs) e funzionalmente come leucociti con capacità citotossica spontanea, consentendo epatica resistenza contro l'istituzione di sangue- metastasi tumorali a carico. L'obiettivo del metodo qui presentato è quello di consentire la raccolta selettiva dei leucociti MH, al fine di studiare questa popolazione cellulare importante ed unico (e vano immunitario), e per chiarire l'impatto delle varie manipolazioni (ad esempio attivazione immunitaria) su queste cellule specifiche.
Nonostante il fallimento di immunità per eliminare un tumore primario in via di sviluppo, prove in pazienti affetti da cancro e modelli animali indicano che il sistema immunitario in grado di controllare le cellule tumorali, micrometastasi e malattia residua throu circolantiGH immunità cellulo-mediata (CMI). Tuttavia, vi è una contraddizione apparente tra questi in capacità vivo e in vitro negli esseri umani e negli animali, che dimostrano che la maggior parte delle cellule tumorali autologhe sono resistenti alla citotossicità dai leucociti splenici 1,2 circolanti o. Questa incoerenza può essere attribuita, almeno in parte, l'esistenza in vivo di una distinta sottopopolazione leucocitaria, cioè i (sinusoidi) leucociti marginating-epatico e la sottopopolazione di cellule NK attivate, ovvero cellule pit 3. Infatti, dati non pubblicati dal nostro laboratorio hanno indicato che nei ratti F344 cellule tumorali singenici (MADB106), che sono stati trovati resistenti alla circolazione e milza leucociti, sono stati lisati dalle cellule NK MH-4. Così, le cellule tumorali che sono presumibilmente "NK-resistente" leucociti circolanti possono essere comandate da cellule MH-NK. Degno di nota, nei topi l'attività maggiore di MH-NK è evidente solo dopo in vivo immunitariostimolazione (ad esempio attraverso l'uso di Poly I: C o CpG-C) 5.
Le cellule NK-specific fegato (MH-NK) sono situati all'interno del lume sinusoidali, aderendo alle cellule endoteliali e cellule di Kupffer. Cellule NK-MH sono caratterizzati esclusivamente da granuli densi sferici e vescicole asta animato 6, che contengono la fosfatasi acida come enzimi lisosomiali, e perforina e granzimi come sostanze bioattive 7,8. Rispetto alle cellule NK circolanti, cellule NK-MH presentano un maggior numero e le dimensioni dei granuli e vescicole 9-11. In condizioni infiammatorie, cellule NK-MH hanno dimostrato di esibire espressione maggiore di LFA-1 12, rispetto alle cellule NK circolanti. Questa espressione maggiore potrebbe costituire un meccanismo attraverso il quale le cellule NK-MH sono più citotossica nei confronti di alcune cellule tumorali rispetto alle cellule NK 13,14 circolanti. nterestingly, dopo incubazione in vitro con interleuchina (IL) -2, cellule NK-MH diventano allargata, eil loro numero e le dimensioni dei granuli aumentano, che sono tutti coerenti con un pro fi lo di assassino linfochine attivato cellule 15 (LAK).
leucociti MH attivi non possono essere ottenuti esclusivamente attraverso i metodi di raccolta dei leucociti del fegato standard, che si basano sulla macinazione e degradazione biologica del tessuto. Il nostro approccio perfusione descritto ha due importanti vantaggi rispetto agli approcci standard. Innanzitutto, l'approccio perfusione raccoglie selettivamente leucociti MH, prevenire la contaminazione da altri leucociti da altri compartimenti fegato. In secondo luogo, la tecnica di perfusione meglio preserva l'integrità, l'attività e l'ambiente fisiologico dei leucociti MH, a differenza del trattamento tessuti approcci che danneggiano le cellule o alterare la loro morfologia, ea causa di danni ai tessuti, induce il rilascio di vari fattori che marcatamente modulano immunitario attività.
Il fegato è un importante organo bersaglio per le metastasi del cancro unaND per varie infezioni 16. Come le cellule MH presentano caratteristiche uniche, è importante studiare questa specifica popolazione in varie condizioni rispetto a queste patologie. Ad esempio, è degno di nota che l'attivazione immunitaria sistemica da vari BRM (ad esempio poli I: C o CpG-C) hanno dimostrato di attivare MH-leucociti più di leucociti 5 circolanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di perfusione epatica presentato qui permette una raccolta selettiva e lo studio della popolazione unica di marginating leucociti epatici. NK cellule epatiche, anche chiamate cellule pit 3, costituiscono una popolazione di cellule NK distintivo che risiedono nei sinusoidi epatici. Si trovano in ratti, topi e negli esseri umani 17 18,19. Rispetto al isolate cellule NK periferico, cellule pit dimostrato superiore citotossicità contro YAC-1 e CC531s linee cellulari bersaglio <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors and this work were supported by NIH/NCI grant # R01CA172138 (to SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
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