Colheita seletiva de Marginating-hepática Leucócitos

Summary

Marginating-hepatic leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe a method for selective harvesting of this specific hepatic cell population, through forced perfusion of the liver of rats or mice. Marginating-hepatic leukocytes seem critical in determining susceptibility to hepatic-related diseases and metastases.

Abstract

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Specifically, evidence suggests a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MH-leukocyte population and higher cytotoxicity of liver-specific NK cells (namely, pit cells) compared to circulating or splenic immunocytes in both mice and rats. The method presented herein enables selective harvesting of MH leukocytes by forced perfusion of the liver in mice and rats. In contrast to other methods used to extract liver-leukocytes, including tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the liver sinusoids, uncontaminated by cells from other liver compartments. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MH leukocytes, sparing known physiological responses to tissue processing. As many circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the liver sinusoids, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes, the unique MH leukocyte population is strategically located to interact, identify, and react towards aberrant circulating cells. Thus, selective harvesting of MH-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of the biological and clinical significance of MH leukocytes, specifically with respect to circulating aberrant cells and liver-related diseases and cancer metastases.

Introduction

Os sinusóides do fígado contêm numerosos subtipos de leucócitos de várias actividades imunes críticos para o organismo. Por exemplo, marginating hepática células natural killer (MH) (NK), também conhecidas como células pit, são caracterizados morfologicamente como grandes linfócitos granulares (LGLs) e funcionalmente como leucócitos com capacidade citotóxica espontânea, permitindo hepática resistência contra o estabelecimento de análises ao sangue metástases tumorais Borne. O objectivo do método aqui apresentado é o de permitir a colheita selectiva de leucócitos MH, a fim de estudar esta população de células importante e original (e compartimento imune), e para elucidar o impacto de várias manipulações (por exemplo, activação imune) sobre essas células específicas.

Apesar do fracasso da imunidade para eliminar o desenvolvimento de um tumor primário, provas em pacientes com cancro e em modelos animais indicam que o sistema imune pode controlar células tumorais, micrometástases e de doença residual que circula atraimunidade mediada por células GH (CMI). No entanto, existe uma aparente inconsistência entre estes em capacidades in vivo e in vitro em seres humanos e em animais, que demonstram que a maioria das células tumorais autólogas são resistentes a citotoxicidade pela circulação de leucócitos ou esplénicas ^1,2. Esta inconsistência pode ser atribuída, pelo menos em parte, à existência in vivo de uma subpopulação de leucócitos distintas, a saber, os sinusóides (leucócitos) marginating-hepático e a sua sub-população de células NK activadas, nomeadamente células pit ^3. Com efeito, dados não publicados do nosso laboratório indicaram que em ratos F344 células tumorais singénicas (MADB106), as quais foram consideradas resistentes à circulação e esplénicos leucócitos, foram submetidas a lise por células NK ^MH-4. Assim, as células tumorais que são "resistente NK-" alegadamente para leucócitos circulantes podem ser controlados por células NK-MH. Notável, em ratos o aumento da atividade de MH-NK é evidente apenas seguir in vivo imunológicoestimulação (por exemplo, através da utilização de poli I: C ou CpG-C) ^5.

células NK específico do fígado (MH-NK) estão situados dentro do lúmen sinusoidais, aderir às células endoteliais e células de Kupffer. Células MH-NK são caracterizados exclusivamente por grânulos densos esféricas e vesículas com núcleo de haste ^6, que contêm fosfatase ácida como enzimas lisossomais e perforina e granzimas como substâncias bioativas ^7,8. Em comparação com células NK circulantes, células-NK MH exibem um maior número e tamanho dos grânulos e vesículas ^9-11. Sob condições inflamatórias, células-NK foram MH mostrado exibir maior expressão de LFA-1 ^12, em comparação com células NK circulantes. Esta expressão aumentada pode constituir um mecanismo pelo qual as células NK-MH é mais citotóxico contra certas células tumorais do que as células NK circulantes ^13,14. nterestingly, após incubação in vitro com a interleucina (IL) -2, células-NK MH tornou alargada, eo seu número e tamanho de grânulos de aumentar, os quais são consistentes com uma pro fi le de assassinas activadas por linfocina (LAK) células ^15.

leucócitos MH activas não podem ser obtidos exclusivamente através dos métodos de colheita de leucócitos no fígado padrão, os quais são baseados na moedura e degradação biológica do tecido. A nossa abordagem perfusão aqui descrito possui duas grandes vantagens em comparação com os métodos normais. Em primeiro lugar, a abordagem de perfusão colhe seletivamente leucócitos MH, evitando a contaminação por outros leucócitos de outros compartimentos do fígado. Em segundo lugar, a técnica de perfusão melhor preserva a integridade, a actividade, e o meio fisiológico de leucócitos MH, ao contrário do processamento de tecidos abordagens que danificam as células ou alteram a sua morfologia, e devido ao dano do tecido, induzir a libertação de vários factores que marcadamente modular imune atividade.

O fígado é um dos principais alvos de metástase de câncer dend para várias infecções ^16. Como as células MH apresentam características únicas que é importante estudar essa população específica sob várias condições no que diz respeito a estas patologias. Por exemplo, é digno de nota que a activação imunitária sistémica por vários BRMs (por exemplo, poli I: C ou CpG-C) têm mostrado activar MH-leucócitos mais do que ⁵ leucócitos circulantes.

Protocol

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Tel-Aviv. Protocolo 1. Ratos preparativos Preparar a solução de PBS heparinizado (30 unidades / ml) para ser utilizado à temperatura ambiente (RT) por adição de 30 unidades de heparina livre de conservante por ml de tampão fosfato salino (PBS) 1x solução. Calcular 35 ml por animal. Passe heparin…

Representative Results

Em ratos F344 comparou-se a citotoxicidade de células NK-MH (recolhida das sinusóides do fígado por perfusão do fígado forçada) para citotoxicidade de toda a população de células de fígado após trituração mecânica do tecido do fígado, e para a citotoxicidade de leucócitos circulantes. Todas as preparações celulares foram lavadas, pelo menos, 3 vezes, como rotina em ensaios imunológicos, e como linhas de células alvo foi utilizado o alogénico de YAC-1 ou as linhas de …

Discussion

O método de perfusão do fígado aqui apresentada permite uma colheita selectiva e estudo da população única de marginating leucócitos hepáticas. Células hepáticas NK, também chamados de células pit ^3, constituem uma população distinta de células NK que residem nos sinusóides hepáticos. Eles são encontrados em ratos, ratos ¹⁷ e em humanos ^18,19. Em comparação com células NK periféricas isoladas, células pit demonstraram maior citotoxicidade contra YAC-1 e CC531s linh…

Materials

Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle	OMG		26G
Butterfly needle	OMG		21G*3/4"
Syringe	Pic solution		1 ml
Syringe	Pic solution		2.5 ml
Syringe	Pic solution		5 ml
Syringe	Pic solution		10 ml
Syringe	Pic solution		25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp