인간 공막의 공 초점 현미경을 수행하기 위해 코팅 기술을 사용하여
Summary
Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Abstract
공막 커버와 눈을 보호하는 조밀 한 결합 조직이다. 그것은 주로 조밀 한 콜라겐 번들 (유형 I, III, IV, V, VI와 VII)로 구성되어있다. 그것의 형광도, 불투명, 두께에, 그것은 공 초점 현미경에 적합한 발견되지 않았습니다. 항원 검색을 위해 조직을 예열 특히, 면역을 위해 파라핀 포르말린 고정 공막을 사용하는 기술적 과제를 갖고 여기에 제시된 하나의 대체 방법. 공막 세포와 혈관을 모두 상대적으로 열악하기 때문에, 큰 조직 샘플의 사용을 보이는 세포를 방지하고, 선박 등의 해부학 적 부위에 관련된 자신의 위치 파악을 이해하는 데 도움이 모색되었다. 공 초점 현미경 큰 조직 샘플의 분석을 허용하기 위해, 적층 기술은 공막의 얇은 층을 생성하고자 하였다. CD31 혈관 및 림프관 내피 hyalu 결과의 분석에 따라로난 수용체 1 (LYVE1) 과학 시험에 대한 승인을 얻었다있는 양성 세포는,이 방법의 장점과 제한 사항이 설명되어 있습니다.
Introduction
공막은 조밀 한 결합 조직으로 구성되어 눈을 덮고있는 단단한 외부 층이다. 이것은 인공 구조물을 보호하기 위해 안압을 유지하도록 돕는다. 따라서, 공막은 명확한 비전을 위해 필수적이다. 그것은 림프 혈관 1,2없는 상태이며, 따라서 그것과 림프없는 내 눈 3-7 사이의 외부 림프없는 경계를 형성한다. 또한하여 힘줄과 해부학 적 유사성을 공유하고, 안구 근육 첨부 파일 사이트를 제공합니다. 공막은 주로 I 콜라겐 유형의 밀도가 번들로 구성되어 있으며 콜라겐 유형 III, IV, V, VI, VIII 8,9과 엘라스틴 10, 11의 작은 숫자를 가지고 있기 때문에,이 조직은 면역 조직 화학 염색을 위해 사용하기 쉬운 일이 아니다.
(1) 표면 혈관 episclera, 결막 및 장부의 캡슐 아래에 발견하고 측면과 일을 향해 : 해부학, 공막은 세 가지 주요 계층으로 분리 될 수있다궤도 대향 눈 E의 뒷면; (2) 기질 공막은 공막의 주요부; 및 (3) 바로 위에 위치 포도막 얇은 착색 층 라미 fusca를. 공막에 대한 우리의 해부학 적 지식은 20 세기의 전반부에서 주로 유래한다. 당시 연구자들은 주로 인도 잉크 주입 (12)를 사용하여 혈관이 13 ~ 15 주조에 의해 혈관의 해부학을 공부했다. 나중에, 그 혈관 16-19 연구에서 조사되었다.
그 이후로, 이전 기술이 향상되었으며 새로운 우리가 이전 해부학 적 지식을 보완 할 수있는 개발되었다. 우리는 림프계 혈관 내피 히알루 특정 수용체 -1 (LYVE1) 20 21 podoplanin 같은 신뢰성 림프 마커 가지고 이후 예를 들어, 단지 약 십왔다. 공 초점 현미경은 다른 TI의 해부학 적 특징을 연구에 대한 새로운 가능성을 제공합니다눈의 ssues. 여러 얼룩 세포의 분화 마커 나 혈관 등의 해부학 적 구조에 관하여 셀의 위치 파악에 사용하는 것은 허용한다. 샘플이 더 큰 크기이며 때 특정 세포 유형의 검색에서 우리가 샘플을 통해 검색 할 수 있습니다 때 개요를 제공합니다. Z 스택 기술, 공 초점 현미경은 100-200 μm의 최대 샘플을 사용할 수있다. 공막은 근육 삽입 뒤에 0.3 mm와 극부 (11)에서 1mm 사이의 두께가 다르다. 두께와 불투명 모두으로 인해 공막은 기존의 방법을 사용하여 공 초점 현미경에 적합하지 않습니다.
이 문제를 해결하려면, 공막 조직은 공 초점 현미경과의 분석을 할 수 있도록 적층 하였다. 이 기술은 인간 공막 모두 생리적 및 병리학 적 상황에서의 더 나은 이해를 얻는 데 유용하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간 공막을 적층하여이 조직에 공 초점 현미경 검사를 수행하는 방법이다. 이 과정에서 중요한 단계는 조직을 부착에 대한 에탄올의 사용 대신 포르말린이다. 고정 에탄올 대신 포르말린을 사용하는 경우 우리의 경험에서 더 나은 결과를 얻을 수있다. 블런트 메스는 절차를 악화 피해야한다. 마찬가지로, 공막의 고갈은이 절차를 복잡하게하고, 화상의 품질을 감소시키기 때문에 피해야한다.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
Materials
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a | |
References
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