Usando una técnica de laminación para realizar la microscopía confocal de la esclerótica humana
Summary
Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.
Abstract
La esclerótica es un tejido conectivo denso que cubre y protege el ojo. Se compone principalmente de fibras de colágeno denso (tipos I, III, IV, V, VI, y VII). Debido a su autofluorescencia, opacidad, y el espesor, no se ha encontrado adecuado para microscopía confocal. Un enfoque alternativo a la presentada aquí, que utiliza esclerótica fijado con formalina se incluyeron en parafina para inmunohistoquímica, tiene desafíos técnicos, especialmente cuando el precalentamiento del tejido para la recuperación de antígeno. Desde la esclerótica es relativamente pobre en ambas células y vasos, se exploró el uso de muestras de tejido más grandes para ayudar a prevenir que las células vistas y para entender su localización en relación con los buques y otros sitios anatómicos. Para permitir el análisis de muestras de tejido más grandes en el microscopio confocal, una técnica de laminación se realizó para crear capas delgadas de la esclerótica. Tras el análisis de los resultados de los vasos sanguíneos CD31 y hyalu endotelial de vasos linfáticosRonan receptor 1 (LYVE1) células positivas, para lo cual se obtuvo la aprobación para el examen científico, se discuten las ventajas y limitaciones de este método.
Introduction
La esclerótica es la capa exterior rígida que cubre el ojo, que está hecha de tejido conectivo denso. Ayuda a proteger las estructuras intraoculares y para mantener la presión intraocular. Por lo tanto, la esclerótica es esencial para la visión clara. Está desprovisto de vasos linfáticos 1,2 y de ese modo forma un borde libre-linfático exterior entre él y el ojo interior libre de linfático 3-7. También proporciona sitios de unión para los músculos extraoculares, compartiendo así similitudes anatómicas con tendones. Debido a que la esclerótica se compone principalmente de densos haces de colágeno de tipo I y tiene un número menor de tipos de colágeno III, IV, V, VI, VIII 8,9 y elastina 10,11, este tejido no es fácil de usar para inmunohistoquímica.
Anatómicamente, la esclerótica se puede separar en tres capas principales: (1) la epiesclerótica vascularizado superficial, que se encuentra debajo de la conjuntiva y la cápsula de Tenon y hacia los lados y THCuenta E del ojo hacia la órbita; (2) el estroma escleral, la parte principal de la esclerótica; y (3) la lámina fusca, que es una capa delgada, pigmentada situado directamente encima de la úvea. Nuestro conocimiento anatómico sobre la esclerótica se deriva principalmente de la primera mitad del siglo 20. En ese momento, los investigadores estudiaron la anatomía de la vasculatura principalmente mediante el uso de inyecciones de tinta India 12 y vasculares fundición 13-15. Más tarde, se investigó en estudios angiográficos 16-19.
Desde ese momento, las técnicas más antiguas se han mejorado y otros nuevos han sido desarrollados que nos han permitido complementar los conocimientos anatómicos anterior. Por ejemplo, ha sido solamente alrededor de una década desde que hemos tenido este tipo de marcadores linfáticos fiables como el endotelio vascular linfática hialuronano específico del receptor-1 (LYVE1) 20 o 21 podoplanin. La microscopía confocal ofrece nuevas posibilidades para el estudio de las características anatómicas de los diferentes tiUNDIALES del ojo. Permite múltiples manchas a ser utilizados para diferenciar los marcadores de células o para la localización de las células en relación a los vasos sanguíneos y otras estructuras anatómicas. Proporciona una visión general cuando la muestra es de un tamaño más grande y nos permite escanear a través de una muestra cuando en busca de un tipo específico de célula. Con la tecnología Z-Stack, microscopía confocal se puede utilizar para muestras de hasta 100 a 200 micras. La esclerótica se diferencia de espesor entre 0,3 mm detrás de las inserciones musculares y 1 mm en el polo posterior 11. Debido tanto a su espesor y opacidad, la esclerótica no es adecuado para microscopía confocal utilizando métodos tradicionales.
Para remediar esto, los tejidos esclerales se laminaron para permitir su análisis con el microscopio confocal. Esta tecnología es útil para obtener una mejor comprensión de las dos situaciones fisiológicas y patológicas en la esclerótica humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Laminar la esclerótica humana es un método para realizar la microscopía confocal en este tejido. Un paso crítico en este proceso es el uso de etanol en lugar de formalina para fijar el tejido. En nuestra experiencia, los mejores resultados se obtienen cuando se utiliza etanol en lugar de formol para su fijación. escalpelos Blunt agravan el procedimiento y se deben evitar. Del mismo modo, el agotamiento de la esclerótica debe evitarse, ya que complica el procedimiento y reduce la calidad de las imágenes.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
German Research Foundation (FOR2240 “(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye” to CC and LMH; HE 6743/2-1 and HE 7643/3-1 to LMH; CU47/6-1 to CC), German Cancer Aid (to LMH and CC), GEROK program University of Cologne (to SLS and LMH), and EU COST BM1302 “Joining Forces to Corneal Regeneration” (to CC).
Materials
| 96% ethanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Germany | P075.4 | |
| binocular stereo microscope | Motic, Hongkong, China | n.a | |
| 26G needles | Terumo, Leuven, Belgium | 303800 | |
| 15.5mm trepan | Geuder, Heidelberg, Germany | n.a | |
| no.10 scalpel | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | 2E+08 | |
| ophthalmic scalpel micro feather | Feather, pfm medical, Osaka, Japan | no. 7657BR | |
| CD 31 antibody (monoclonal mouse anti human) | Dako, USA | IR610 | |
| LYVE1 antibody (polyclonal rabbit anti human) | Zytomed, Germany | RBK014-05 | |
| goat anti mouse FITC antibody | Sigma Aldrich, Steinheim, Germany | F0257 | |
| goat anti rabbit Cy3 antibody | Dianova, Germany | 111-165-003 | |
| Goat Serum normal | Dako, Glostrup, Denmark | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 6335.1 | |
| microscope slides | Engelbrecht, Edermünde, Germany | WC7695002 | |
| Coverslips 24x24mm | Th. Gayer, Lohmar, Germany | 7695026 | |
| DAKO fluorescent mounting medium | DAKO, USA | S3023 | |
| LSM Meta 510 confocal microscopy | Carl Zeiss AG, Jena, Germany | n.a | |
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