Målretning Biofilm Associated<em> Staphylococcus aureus</em> Brug Resazurin Baseret Drug-modtagelighed Assay

Summary

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Abstract

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Introduction

Patogene mikroorganismer kan danne biofilm in vivo fører til ikke-akutte kroniske infektioner ^1. Biofilm-associeret infektion er en alvorlig risikofaktor for medicinske procedurer, der involverer implantation af fremmedlegemer (f.eks kunstige ben udskiftninger brystimplantater) eller installation af luftrør rør eller urinkatetre ^2. I disse sammenhænge, ​​antiinfektiva er næsten altid nødvendigt som biofilm-baserede infektioner sjældent blokerede på egen hånd, selv i immunkompetente individer. Staphylococcus aureus er en af de hyppigst forekommende patogener impliceret i biofilm-relaterede komplikationer der opstår under brug af invasive medicinsk udstyr ^3.

Desværre er den meget karakter af biofilm som en beskyttende barriere gør dem mere modstandsdygtige over for behandling end planktoniske celler ^1,4, og evaluering af forudsagt klinisk effekt er en kritisk del af både indledendeudvikling af lægemidler samt resistens overvågning. Der er stigende erkendelse af, at laboratorieforhold, der fokuserer på planktoniske kulturer, ikke kan trofast repræsentere virkelige verden sygdom ^5. Yderligere forværrer problemet, replikering af biofilm fænotyper er vanskelig, og eksisterende biofilm modeller er kedelig og lider høj inter- og intra-assay ⁶ variabilitet. Således mange forskere gennem nødvendighed, standard til planktoniske celle analyser af narkotika modtagelighed, derved potentielt forsømmer et vigtigt aspekt af bakteriel virulens og sygdom.

Her beskriver vi protokol for analyse bakterier, specielt S. aureus, i præ-dyrket biofilm anvendelse af en 96-brønd baseret biofilm systemet ^7,8. Mens protokollen for biofilm dannelse og udfordring følger væsentlige fabrikantens anbefalinger, præsenterer vi en alternativ information-rige metode til kvantificering af levedygtigheden af ​​biofilm efter udfordring. Kort beskrevet bakterier dyrkes i stangen plade, hvor biofilm dannes på de fremspringende tappe fastgjort til pladen låg. Efter biofilmdannelse, er tappene forsigtigt dyppet i brønde i en frisk plade fyldt med PBS for at fjerne planktoniske celler. PEG-låg, med biofilm fastgjort, overføres til en ny udfordring pladen, som indeholdt forskellige koncentrationer af antibiotika, der skal analyseres. Efter en anden inkubation låg fjernes igen, vasket og overført til en genopretning plade indeholdende Resazurinfarvestof, hvor de underkastes en afsluttende inkubation. Resazurin konvertering kan optages kinetisk eller taget som et endepunkt læsning efter en defineret restitutionsperiode. Denne farvestofbaseret metode til kvantificering af levedygtigheden af biofilm adskiller sig væsentligt fra de kedelige CFU (kolonidannende enheder) tælle-metode, der er beskrevet i den oprindelige protokol ^7. OD ₆₀₀ målinger af lægemidlet udfordring plade og tilsætte Resazurin konvertering kinetik tjene som levedygtighed læstouts af planktoniske og biofilm celler henholdsvis tilbyder en hurtig, pålidelig, indholdsrigt og teknisk enkel analyse til biofilm overlevelse.

Protocol

1. Biofilm Indledning Dyrk en kultur af biofilm producerende organisme i et næringsstof rigt medium. Inokulere Staphylococcus aureus stamme Newman i 10 ml Mueller-Hinton-medium fra et glycerol-lager. Udfør alt arbejde, der involverer håndtering af S. aureus med handsker og inden for en biosikkerhed kabinet. Der inkuberes i 16 timer ved 37 ° C på en roterende ryster (100-200 rpm). Bestemme OD600 af kulturen under anvendelse af et spektrofotometer og en stan…

Representative Results

Den resazurin assayet er følsomme nok til at detektere meget få levedygtige celler i stand til at replikere i stoffri medium efter belastning. I denne metode, definerer vi den minimale biofilm udrydde koncentration som den laveste koncentration, ved hvilken ingen resazurin omdannelse ses indenfor 24 timer. Den resazurin analysen bygger på oxidative molekyler findes i metabolisk aktive celler, som omdanner farvestoffet farve fra blå til pink. Dye konvertering er således en indikator …

Discussion

Her har vi beskrevet et modificeret biofilm assay til bestemmelse af aktivitet af testede inhibitorer på S. aureus biofilm med fokus på den metaboliske tilstand af biofilm forbundet celler. Mens den beskrevne biofilm initierings- og provokationseksponeringen meste efterlignede producentens anbefalinger, anvendelse af Resazurinfarvestof at påvise og bestemme biofilm-associerede celler som overlever en 24 hr inhibitor udfordring dramatisk simplificerer den fremgangsmåde af celleindvinding (via vandbad lydbeha…

Materials

Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Follow recommendations of manufacturer
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resin	Bio Rad	142-2822
MBEC-plates	Innovotech	19111
Resazurin Sodium Salt	Sigma	R7017	800µg/ml in DI water     Filter sterile
Micro Plate Shaking Platform	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Biotek
Gen5 software	Biotek		Recording and analysis of resazurin conversion
Neocuproine	Sigma	N1501	prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC
Copper sulfate	Acros Organics	7758-99-8	prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC
Cu-Neocuproine	Self-Made		Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration.
Gentamicin	Sigma	G3632-1G