Biyofilm İlişkili Hedefleme<em> Staphylococcus aureus</emKullanma> Resazurin Tabanlı İlaç-duyarlılık Deneyi
Summary
Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.
Abstract
Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.
Introduction
Patojen mikropların olmayan akut kronik enfeksiyonlara 1 giden in vivo biyofilm oluşturabilir. Biyofilm ilişkili enfeksiyon yabancı cisimler (örneğin, suni kemik değişimleri, meme implantları) veya trakea tüpler veya üriner kateterlerin 2 kurulumu implantasyonu içeren tıbbi prosedürler ciddi bir risk faktörüdür. Biyofilm tabanlı enfeksiyonlar nadiren kendi temizlenir olarak bu bağlamlarda, anti-enfektif tedavi bile immün sistemi sağlıklı bireylerde, hemen hemen her zaman gereklidir. Staphylococcus aureus kullanımı sırasında ortaya çıkan biyofilm ilişkili komplikasyon karıştığı En sık görülen patojenlerden biridir invazif tıbbi cihazlar 3.
Ne yazık ki, koruyucu bir bariyer olarak biyofilm doğası planktonik hücreler 1,4 den tedaviye onları daha dirençli hale getirir ve tahmin klinik etkinliği değerlendirilmesi hem ilk kritik bir parçasıdırilaç geliştirme yanı sıra ilaç direnç gözetim. Planktonik kültürler üzerinde duruldu laboratuvar koşulları, sadakatle gerçek dünya hastalığı 5 temsil olmayabilir artan bildirim yoktur. Sorunu daha bileşik, biyofilm fenotipleri çoğaltma zordur ve mevcut biyofilm modelleri sıkıcı ve yüksek içi ve tahlil değişkenliği 6 muzdarip. Böylece, birçok araştırmacı, zorunluluk yoluyla, böylece potansiyel bakteriyel virulans ve hastalığın önemli bir yönünü ihmal, uyuşturucu duyarlılık planktonik hücre deneyleri için varsayılan.
Burada özellikle, bakteri tahlil için S. protokolü açıklamak aureus, 96 oyuklu bir göre biyofilm sistemi 7,8 kullanarak önceden büyümüş Biyofilmlererde. biyofilm oluşumu ve meydan okuma için protokol esas üreticinin tavsiye takip ederken, biz biof canlılığı ölçülmesi için alternatif bir bilgi açısından zengin bir metodoloji sunmakmücadeleden sonra ilm. Kısaca, bakteriler, biyofilm levhanın kapak takılı çıkıntı yapan mandal üzerinde oluşan mandal plakası, kültürlenir. biyofilm sonra mandal yavaşça planktonik hücrelerini uzaklaştırmak için PBS ile dolu yeni bir levhanın gözleri içine daldırılır. PEG kapaklı ekli biyofilm ile deneye tabi antibiyotik çeşitli konsantrasyonlarını içeren, yeni bir meydan okuma plakasına aktarılır. ikinci bir inkübasyondan sonra, kapaklar daha çıkarılır, yıkanır ve son bir inkübasyon maruz boya, resazurin ihtiva eden bir geri kazanma plakasına aktarılır. Resazurin dönüşüm kinetik kaydedilmiş veya tanımlanmış bir iyileşme döneminden sonra bir bitiş noktası okuma olarak alınabilir. Biyofilm canlılığını nicel Bu boya temelli yöntem sıkıcı CFU (koloni oluşturan birim) önemli ölçüde orijinal protokolde 7'de tarif saymak tabanlı bir metodoloji farklıdır. İlaç meydan plaka ve dönüşüm kinetiği resazurin OD 600 ölçümler canlılığı okundu olarak hizmetbiyofilm hayatta kalmak için hızlı, güvenilir, bilgi açısından zengin ve teknik basit tahlil sunan sırasıyla planktonik ve biyofilm hücrelerinin çıkışları.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, S. üzerinde test inhibitörlerinin aktivitesinin belirlenmesi için bir tadil edilmiş biyofilm tahlili tarif etmişlerdir biyofilm ilişkili hücrelerin metabolik durumuna odaklanan aureus biyofilm. açıklanan biyofilm başlatma ve meydan prosedürleri çoğunlukla taklit üretici tavsiyelerine rağmen, 24 saat inhibitörü meydan hayatta biyofilm ilişkili hücreleri tespit ve ölçmek için boya resazurin kullanımı dramatik hücre (su banyosu sonification aracılığıyla) kurtarma ve so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Saran Kupul for technical assistance. This work was supported in part by NIH grant R01-AI104952 to FW. Further support was provided by the University of Alabama at Birmingham (UAB) Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI027767) that was made possible by the following NIH Institutes: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.
Materials
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development – can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror ‘real-world’ pathogenesis?. Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O’Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
