מיקוד Associated Biofilm<em> Staphylococcus aureus</em> Assay רגישות בסמים בהתבסס Resazurin שימוש
Summary
Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.
Abstract
Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.
Introduction
חיידקים פתוגניים יכולים ליצור biofilms in vivo מוביל לזיהומים כרוניים שאינם חריפים 1. הזיהום הקשורים biofilm הוא גורם סיכון רציני של פרוצדורות רפואיות שכוללות השתלה של גופים זרים (למשל, מחליף עצם מלאכותי, שתלים בחזה) או באמצעות ההתקנה של צינורות לקנה נשימה או צנתרי שתן 2. בהקשרים אלה, טיפול אנטי זיהומיות הוא כמעט תמיד הכרחי כמו זיהומים מבוססים ביופילם נמחקים לעתים רחוקות בכוחות עצמם, אפילו אצל אנשים עם מערכת חיסון תקינים. Staphylococcus aureus הוא אחד מגורמי המחלה העיר לעתים הקרוב ביותר המעורבים סיבוכים הקשורים biofilm המתרחשים במהלך השימוש 3 מכשירים רפואיים פולשניים.
למרבה הצער, טבעו של biofilms כמחסום מגן שהופך אותם עמיד יותר לטיפול מאשר תאי planktonic 1,4, וההערכה של יעילות קלינית חזה היא חלק קריטי של השני ראשוניפיתוח תרופות כמו גם מעקב עמידות לתרופות. יש הכרה גוברת כי בתנאי מעבדה, מתמקדים תרבויות planktonic, לא יכולים לייצג נאמן בעולם האמיתי מחלה 5. עוד הרכבה את הבעיה, השכפול של פנוטיפים biofilm קשה, ומודלים ביופילם קיימים הם מייגעים סובלים הבנת גבוה ולהבדלי תוך assay 6. לכן, חוקרים רבים, דרך צורך, כברירת מחדל מבחני תא planktonic רגישות תרופה, ובכך באופן פוטנציאלי הזנחת היבט חשוב של ארסיויות חיידקים ומחלות.
כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לחיידקי assaying, במיוחד ס aureus, ב biofilms טרום גדל ניצול 7,8 מערכת ביופילם מבוסס 96-היטב. בעוד הפרוטוקול להיווצרות ואתגר ביופילם כדלקמן בעצם המלצת היצרן, אנו מציגים מתודולוגיה מידע עשיר חלופית לכימות את הכדאיות של biofILM לאחר אתגר. בקצרה, חיידקים בתרבית צלחת היתד, שם biofilms להיוצר על היתדות הבולטות המצורפות את המכסה של הצלחת. לאחר ההיווצרות ביופילם, את היתדות הם טבלו בעדינות בבארות של צלחת טריה המלאה PBS להסיר תאי planktonic. PEG-מכסה, עם biofilms המצורפת, מועבר צלחת אתגר חדש, המכיל ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה להיות assayed. לאחר דגירה שנייה, מכסה שוב מוסרים, שטף, והועברתי צלחת התאוששות המכילה resazurin לצבוע, שם הם עוברים דגירה סופית. מרת Resazurin ניתן להקליט kinetically או נלקחת קריאת הסיום לאחר תקופת החלמה מוגדרת. שיטת צבע מבוסס זה לכימות הכדאי של biofilms שונה באופן משמעותי מן (יחידות המושבה להרכיב) CFU המייגעים מתודולוגיה לספור מבוססת כמתואר בפרוטוקול המקורי 7. OD 600 מדידות של צלחת תרופת אתגר resazurin קינטיקה המר לשמש לקריאה כדאיתקטן של תאי planktonic ו biofilm, בהתאמה, המציע assay מהיר, אמין ועשיר במידע ופשוט טכני להישרדות ביופילם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנה, יש לנו תארנו assay biofilm שונה לקביעת פעילות של מעכבים נבדקו על S. biofilms aureus התמקדות מצב מטבולי של תאים הקשורים ביופילם. בעוד נהלים אתגר וייזום ביופילם תיאר בעיקר המלצות היצרן חיקה, השימוש resazurin לצבוע לזהות ולכמת תאים הקשורים biofilm ששורדים אתגר 24 שעות מעכב באופן…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Saran Kupul for technical assistance. This work was supported in part by NIH grant R01-AI104952 to FW. Further support was provided by the University of Alabama at Birmingham (UAB) Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI027767) that was made possible by the following NIH Institutes: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.
Materials
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development – can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror ‘real-world’ pathogenesis?. Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O’Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
