Orientación de Biofilm Asociadas<em> Staphylococcus aureus</em> Uso de Ensayo de susceptibilidad a fármacos Basado resazurina

Summary

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Abstract

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Introduction

Los microbios patógenos pueden formar biopelículas in vivo que conducen a infecciones crónicas no agudos ^1. Infección por biofilm asociado es un factor de riesgo grave de procedimientos médicos que implican la implantación de cuerpos extraños (por ejemplo, substituciones de huesos artificiales, implantes de pecho) o la instalación de los tubos traqueales o catéteres urinarios ^2. En estos contextos, la terapia anti-infecciosa es casi siempre necesario como infecciones basado en biopelícula rara vez se borran por su cuenta, incluso en individuos inmunocompetentes. Staphylococcus aureus es uno de los patógenos más frecuentemente observados implicados en las complicaciones relacionadas con la biopelícula que se producen durante el uso de dispositivos médicos invasivos ^3.

Desafortunadamente, la naturaleza misma de biofilms como una barrera protectora hace más resistentes al tratamiento que las células planctónicas ^1,4, y la evaluación de la eficacia clínica predicho es una parte crítica de tanto inicialel desarrollo de fármacos, así como vigilar la resistencia. Existe una creciente reconocimiento de que las condiciones de laboratorio, se centró en las culturas planctónicos, pueden no representar fielmente la enfermedad en el mundo real ^5. Agravando aún más el problema, la replicación de los fenotipos de biopelícula es difícil, y los modelos de biopelículas existentes son tediosos y sufren de alta variabilidad inter e intra-ensayo ^6. Por lo tanto, muchos investigadores, por necesidad, por defecto a ensayos de células planctónicas de susceptibilidad a los fármacos, lo que potencialmente descuidar un aspecto importante de la virulencia bacteriana y la enfermedad.

Aquí se describe el protocolo para el ensayo de bacterias, específicamente S. aureus, en los biofilms pre-crecido que utilizan un sistema de biopelícula ^7,8 basadas en 96 pocillos. Mientras que el protocolo para la formación de biopelículas y el desafío sigue esencialmente la recomendación del fabricante, se presenta una metodología rica en información alternativa para cuantificar la viabilidad de la bioFILM después de la exposición. Brevemente, las bacterias se cultivan en la placa de clavija, donde las biopelículas se forman en las clavijas sobresalientes unidos a la tapa de la placa. Después de la formación de biopelículas, las clavijas se sumergen suavemente en pocillos de una placa fresca llena con PBS para eliminar las células planctónicas. El PEG-tapa, con biofilms adjuntos, se transfiere a una nueva placa de desafío, que contiene varias concentraciones de antibióticos a ensayar. Después de una segunda incubación, las tapas se retiran de nuevo, se lavaron y se transfirieron a una placa de recuperación que contiene resazurina tinte, donde se someten a una incubación final. conversión resazurina se puede grabar cinéticamente o toma como una lectura de punto final después de un período de recuperación definido. Este método basado en el colorante de la cuantificación de la viabilidad de biofilms difiere considerablemente de las CFU (unidades formadoras de colonias) tediosas metodología basada en contar se describe en el protocolo original ^7. OD ₆₀₀ mediciones de la placa desafío de las drogas y resazurina cinética de conversión sirven como lectura viabilidadouts de células planctónicas y biofilm, respectivamente, que ofrecen un ensayo rápido, fiable, rico en información y técnicamente simple para la supervivencia de biopelículas.

Protocol

1. Iniciación de biopelículas Hacer crecer una cultura de producción de biofilm organismo en un medio rico en nutrientes. Inocular Staphylococcus aureus cepa Newman en 10 ml de medio Mueller-Hinton de un stock de glicerol. Realizar todos los trabajos que impliquen la manipulación de S. aureus con guantes y dentro de una cabina de bioseguridad. Incubar durante 16 horas a 37 ° C en un agitador rotatorio (100 a 200 rpm). Determinar DO600 del cultivo usando un…

Representative Results

El ensayo de la resazurina es suficientemente sensible para detectar con fiabilidad muy pocas células viables capaces de replicarse en medio libre de fármaco después de la exposición. En esta metodología, se define el biofilm erradicar la concentración mínima como la concentración más baja a la que no se observa una conversión de resazurina dentro de las 24 horas. El ensayo se basa en la resazurina moléculas oxidativas que se encuentran en las células metabólicamente activas…

Discussion

Aquí, hemos descrito un ensayo de biopelícula modificado para determinar la actividad de los inhibidores de la prueba sobre S. biopelículas aureus que se centran en el estado metabólico de las células del biofilm asociado. Mientras que la iniciación de la biopelícula se describe y procedimientos reto recomendaciones del fabricante sobre todo imitaba, el uso de resazurina tinte para detectar y cuantificar las células del biofilm-asociado que sobreviven a un desafío inhibidor de 24 hr simplifica…

Materials

Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Follow recommendations of manufacturer
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resin	Bio Rad	142-2822
MBEC-plates	Innovotech	19111
Resazurin Sodium Salt	Sigma	R7017	800µg/ml in DI water     Filter sterile
Micro Plate Shaking Platform	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Biotek
Gen5 software	Biotek		Recording and analysis of resazurin conversion
Neocuproine	Sigma	N1501	prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC
Copper sulfate	Acros Organics	7758-99-8	prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC
Cu-Neocuproine	Self-Made		Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration.
Gentamicin	Sigma	G3632-1G