लक्ष्य निर्धारण Biofilm एसोसिएटेड<em> स्ताफ्य्लोकोच्चुस</em> का प्रयोग Resazurin आधारित दवा-परख संवेदनशीलता
Summary
Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.
Abstract
Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.
Introduction
रोगजनक रोगाणुओं गैर तीव्र पुराने संक्रमण 1 के लिए अग्रणी विवो में biofilms फार्म कर सकते हैं। Biofilm से जुड़े संक्रमण चिकित्सा प्रक्रियाओं है कि विदेशी वस्तुओं (जैसे, कृत्रिम हड्डी प्रतिस्थापन, स्तन प्रत्यारोपण) या सांस की नली ट्यूब या मूत्र कैथेटर 2 की स्थापना का आरोपण शामिल की एक गंभीर जोखिम कारक है। इन संदर्भों में, विरोधी संक्रामक चिकित्सा लगभग हमेशा आवश्यक के रूप में biofilm आधारित संक्रमण को शायद ही कभी अपने दम पर मंजूरी दे दी है, असुरक्षित व्यक्तियों में भी है। स्ताफ्य्लोकोच्चुस सबसे अधिक बार मनाया के उपयोग के दौरान होने वाली biofilm से संबंधित जटिलताओं में फंसा रोगाणुओं की एक है आक्रामक चिकित्सा उपकरणों 3।
दुर्भाग्य से, एक सुरक्षात्मक बाधा के रूप में biofilms के स्वभाव उन्हें और अधिक planktonic कोशिकाओं 1,4 से उपचार के लिए प्रतिरोधी बनाता है, और भविष्यवाणी की चिकित्सीय प्रभावकारिता के मूल्यांकन के दोनों प्रारंभिक का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैदवा के विकास के साथ-साथ दवा प्रतिरोध निगरानी। वहाँ बढ़ती पावती कि प्रयोगशाला की स्थिति, planktonic संस्कृतियों पर केंद्रित है, ईमानदारी से वास्तविक दुनिया की बीमारी 5 प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है। आगे की समस्या और जटिल हो, biofilm phenotypes की प्रतिकृति मुश्किल है, और मौजूदा biofilm मॉडल थकाऊ रहे हैं और उच्च अंतर और इंट्रा-परख 6 परिवर्तनशीलता से पीड़ित हैं। इस प्रकार, कई शोधकर्ताओं, आवश्यकता के माध्यम से, मादक पदार्थों की संवेदनशीलता की planktonic सेल assays के लिए डिफ़ॉल्ट, जिससे संभवतः बैक्टीरियल विषैलापन और रोग का एक महत्वपूर्ण पहलू की उपेक्षा।
यहाँ हम बैक्टीरिया परख करने की क्रिया के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है, विशेष रूप से एस ऑरियस, एक 96 अच्छी तरह से आधारित biofilm प्रणाली 7.8 का उपयोग पूर्व विकसित biofilms में। biofilm गठन और चुनौती के लिए प्रोटोकॉल अनिवार्य रूप से निर्माता की सिफारिश इस प्रकार है, हम biof की व्यवहार्यता बढ़ाता के लिए एक विकल्प के बारे में जानकारी युक्त कार्यप्रणाली पेशचुनौती के बाद इल्म। संक्षेप में, बैक्टीरिया खूंटी थाली, जहां biofilms प्लेट के ढक्कन से जुड़ी फैला हुआ खूंटे पर फार्म में सुसंस्कृत हैं। biofilm गठन के बाद, खूंटे धीरे एक ताजा पीबीएस के साथ भरा planktonic कोशिकाओं को हटाने के लिए थाली के कुओं में डूबा रहे हैं। खूंटी ढक्कन, संलग्न biofilms के साथ, एक नई चुनौती प्लेट को सौंप दिया है, एंटीबायोटिक दवाओं के विभिन्न सांद्रता वाले यत्न किया जाएगा। एक दूसरे ऊष्मायन के बाद, पलकों फिर से हटा दिया धोया, और डाई, जहां वे एक अंतिम ऊष्मायन से गुजरना resazurin युक्त एक वसूली थाली करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। Resazurin रूपांतरण kinetically दर्ज की गई है या एक परिभाषित वसूली की अवधि के बाद एक समापन बिंदु पढ़ने के रूप में लिया जा सकता है। Biofilms की व्यवहार्यता बढ़ाता का यह डाई आधारित पद्धति थकाऊ CFU (कॉलोनी बनाने इकाइयों) से काफी अलग मूल प्रोटोकॉल 7 में वर्णित गिनती आधारित पद्धति। दवा चुनौती थाली की और रूपांतरण कैनेटीक्स resazurin 600 आयुध डिपो माप व्यवहार्यता पढ़ें के रूप में सेवाplanktonic और biofilm कोशिकाओं, क्रमशः के बहिष्कार, एक तेज, विश्वसनीय, जानकारी से भरपूर और तकनीकी रूप से सरल biofilm अस्तित्व के लिए परख की पेशकश की।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम एस पर परीक्षण अवरोधकों की गतिविधि का निर्धारण करने के लिए एक संशोधित biofilm परख का वर्णन किया है biofilm जुड़े कोशिकाओं की चयापचय राज्य पर ध्यान केंद्रित कर ऑरियस biofilms। जबकि वर्णित biofilm दीक्षा और च?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Saran Kupul for technical assistance. This work was supported in part by NIH grant R01-AI104952 to FW. Further support was provided by the University of Alabama at Birmingham (UAB) Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI027767) that was made possible by the following NIH Institutes: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.
Materials
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
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