Targeting Biofilm Associated<em> Staphylococcus aureus</em> Bruke Resazurin Basert Narkotika mottakelighet analyse

Summary

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Abstract

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Introduction

Patogene mikrober kan danne biofilmer in vivo fører til ikke-akutte kroniske infeksjoner ^1. Biofilm-assosiert infeksjon er en alvorlig risikofaktor for medisinske prosedyrer som involverer implantering av fremmedlegemer (f.eks kunstig bein erstatninger, brystimplantater) eller installasjon av trakealtubers eller urinkateter ^2. I disse sammenhenger, er anti-infektiv terapi nesten alltid nødvendig som biofilm-baserte infeksjoner er sjelden fjernet på egen hånd, selv i immunkompetente personer. Staphylococcus aureus er en av de mest hyppigst observerte patogener innblandet i biofilm-relaterte komplikasjoner som oppstår under bruk av invasiv medisinsk utstyr ^3.

Dessverre, selve innholdet av biofilm som en beskyttende barriere som gjør dem mer motstandsdyktige mot behandling enn planktoniske celler ^1,4, og evaluering av forventet klinisk effekt er en viktig del av både innledendelegemiddelutvikling samt resistens overvåking. Det er økende erkjennelse av at laboratorieforhold, fokusert på planktoniske kulturer, kanskje ikke trofast representerer reell sykdom ^fem. Ytterligere compounding problemet, er replikering av biofilm fenotyper vanskelig, og eksisterende biofilm modeller er kjedelige og lider av høyt inter- og intra-assay ⁶ variabilitet. Dermed mange forskere, gjennom nødvendighet, som standard planktoniske celleanalyser av resistens, for derved potensielt å neglisjere et viktig aspekt av bakteriell virulens og sykdom.

Her beskriver vi protokollen for analyse av bakterier, spesielt S. aureus, i pre-vokst biofilmer benytte en 96-brønn basert biofilm system ^7,8. Mens protokollen for biofilmdannelse og utfordring følger i hovedsak anbefaling fra produsenten, presenterer vi en alternativ informasjonsrikt metodikk for kvantifisering av levedyktighet av biofilm etter utfordring. I korthet bakterier er dyrket i pluggen plate, hvor biofilmer dannes på de utstikkende tapper som er festet til platen lokket. Etter at biofilmdannelse blir pinnene forsiktig dyppet i brønner i en ny plate som er fylt med PBS for å fjerne planktoniske celler. PEG-lokk, med biofilm festet, blir overført til en ny utfordring plate, inneholdende forskjellige konsentrasjoner av antibiotika skal bli analysert. Etter en andre inkubasjon, blir lokkene igjen fjernet, vasket og overført til en plate inneholdende gjenvinning av Resazurin fargestoff, hvor de gjennomgår en endelig inkubering. Resazurin konvertering kan tas opp kinetisk eller tas som et endepunkt lesing etter en definert utvinning perioden. Dette dye-basert metode for å kvantifisere levedyktighet av biofilm avviker betydelig fra de kjedelige CFU (colony forming units) teller basert metodikk beskrevet i den opprinnelige protokollen ^7. OD ₆₀₀ målinger av medikamentet utfordringen platen og resazurin konverteringskinetikk tjene som levedyktighet lestouts av planktoniske og biofilmceller, henholdsvis, og tilbyr en rask, pålitelig, informasjonsrike og teknisk enkel analyse for biofilm overlevelse.

Protocol

1. Biofilm Innvielse Dyrk en kultur av biofilm produserende organisme i et næringsrikt medium. Vaksinere Staphylococcus aureus stamme Newman i 10 ml Mueller-Hinton medium fra en glyserol lager. Utføre alt arbeid med håndtering av S. aureus med hansker og innen biosikkerhet skap. Inkuber i 16 timer ved 37 ° C på en rotasjonsrister (100-200 rpm). Bestemme OD 600 av kulturen ved hjelp av et spektrofotometer, og en standard kuvette (banelengde: 1 cm). <li…

Representative Results

Resazurin-analysen er følsom nok til å detektere meget pålitelig måte få levedyktige celler som er i stand til å replikere i medikamentfritt medium etter utfordring. I denne metoden, definerer vi den minimale biofilmen utrydd konsentrasjon som den laveste konsentrasjon ved hvilken ingen resazurin omdannelse sees innen 24 timer. Den resazurin analysen er avhengig av oksidative molekyler som finnes i metabolsk aktive celler som omdanner fargestoff farge fra blått til rosa. Dye omdan…

Discussion

Her har vi beskrevet en modifisert biofilm-assay for bestemmelse av aktiviteten av testede inhibitorer på S. aureus biofilmer med fokus på den metabolske tilstand av biofilm forbundet celler. Mens den beskrevne biofilm initiering og duell prosedyrer for det meste etterlignet produsentens anbefalinger, bruk av Resazurin fargestoff for å påvise og kvantifisere biofilm-assosierte celler som overlever en 24-timers-inhibitor utfordring forenkler dramatisk den anbefalte fremgangsmåten i cellegjenvinning (via van…

Materials

Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Follow recommendations of manufacturer
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resin	Bio Rad	142-2822
MBEC-plates	Innovotech	19111
Resazurin Sodium Salt	Sigma	R7017	800µg/ml in DI water     Filter sterile
Micro Plate Shaking Platform	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Biotek
Gen5 software	Biotek		Recording and analysis of resazurin conversion
Neocuproine	Sigma	N1501	prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC
Copper sulfate	Acros Organics	7758-99-8	prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC
Cu-Neocuproine	Self-Made		Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration.
Gentamicin	Sigma	G3632-1G