Protocol
Aviaire embryo's worden niet beschouwd als gewervelde dieren onder IUCAC regelgeving.
1. Verkrijgen Embryo Heelkunde
- Incubeer 80-90 Bovan bevruchte kippeneieren (stomp eindigen) in een bevochtigde (60%) rocker incubator bij 40 ° C gedurende ongeveer 72 uur tot embryo's in Hamilton en Hamburger (HH) fase te verkrijgen 17. Exact aantal eieren gebaseerd op macht analyse en overleving van embryo's 17. Gebruik plastic ei trays voor broederijen voldoende luchtcirculatie mogelijk te maken.
- Zodra deze gewenste ontwikkelingsstadium wordt bereikt, giet ongeveer 20 ml warm (37 ° C) Tyrode buffer (aangevuld met natriumbicarbonaat (1 g / l)) in een 100 mm x 26 mm petrischaal.
- Steriliseren een ei shell met 70% ethanol.
- Voorzichtig kraken de schelp met een scalpel handvat en zorgvuldig de inhoud vrijkomen in het schaaltje met Tyrode buffer. Gooi embryo's als (i) zij visueel weergegeven abnormaal (ii) zijniet op de juiste ontwikkelingsfase (iii) zij zijn niet goed georiënteerd op de dooier en / of (iv) eventuele bloeden optreedt. Bewaren alle embryo's waarvoor de operatie onmiddellijk nadat geplaatst ex ovo bij 40 ° C teneinde niet ontwikkeling compromitteren.
Opmerking: Staging is uitgevoerd op basis van Hamilton en Hamburger 18. Abnormale kippenembryo's wordt bepaald met het blote oog en onder de dissectie scope. Zorg ervoor dat de embryo juiste vouwen en buigen en vaatstelsel.
2. OFT Banding
- Tweeze uit individuele 1 cm lange draden van een enkele 11/0 nylon chirurgisch hechtdraad en vormen een losse knot. UV steriliseren alle voorgevormde knopen.
- Onder een dissectie microscoop, visueel ervoor zorgen dat het hart klopt op een normaal tarief (~ 120 slagen / min). Zo niet, gooi het embryo.
- Vlak voor de operatie, van toepassing 5-6 ml warme (37 ° C) Tyrode buffer om de embryo oppervlak met transferpipet.
- Passeren een vrij uiteinde van de voorgevormde knoop onder OFT Plaats de hechting aan het OFT / ventrikel knooppunt (OVJ) (of gewenste locatie), en voorbij het vrije uiteinde in de knoop waardoor het OFT vernauwen inclusief de vliezen rond het hart.
- Na de operatie nat het oppervlak van de dooier met 5-6 ml warme (37 ° C) Tyrode buffer met een transferpipet.
- Handhaaf controle embryo's ex ovo als gestreepte embryo's; echter ze niet onderwerpen aan de chirurgische procedure.
- Incubeer de embryo, de gewenste tijd bij 40 ° C in een bevochtigde (60%) incubator.
- Zodra het gewenste tijdstip wordt bereikt, uitsnijden van het embryo uit de dooier gebruik van rechte schaar. Ontleden het hart met fijne pincet en gebruik voor verschillende stroomafwaartse studies zoals veranderingen in cardiale morfologie als gevolg van veranderde hemodynamiek 17.
3. bevestigt dat de Banding Interventie veroorzaakt een verandering in de hemodynamica
Opmerking: De partiële vernauwing door het verbinden interventie leidt tot een toename van de bloedstroomsnelheid in de OVJ. Deze hemodynamische parameter wordt geschikt bepaald met 2D echografie, die wordt uitgevoerd op het gewenste tijdstip van het experiment.
- Omdat slechts één embryo kan worden afgebeeld tegelijkertijd handhaven alle embryo's die voor ultrasone beeldvorming in een 40 ° C incubator.
- Plaats de petrischaal die het embryo te beelden op een verwarmingselement ingesteld op 40 ° C.
- De schaal wordt, tot de rand met warm (37 ° C) Tyrode buffer. Giet langzaam de bufferoplossing in de schaal teneinde de dooier intact. Indien echter de integriteit van de dooier wordt aangetast tijdens deze stap, gooi het embryo.
- Plaats de embryo zodanig dat de hartlijn van het embryo loodrecht op de ultrasone sonde die is opgehangen aan een verstelbare standaard.
- Met het echoapparaat operating in de B-modus, het verkrijgen van een 2D-beeld van het kloppend hart op het scherm en beweeg het podium (verwarming pad), zodanig dat de OFT, hartkamer en OVJ zijn duidelijk zichtbaar.
- Schakelen naar de modus gepulste golf (PW), op de gewenste pulsherhalingsfrequentie (bijvoorbeeld 20 kHz) en snelheidsgegevens precies verkrijgen tegen de OVJ. A B-mode beeld van het kloppende hart wordt verkregen op het scherm.
- Verplaats het podium om de OFT, ventrikel en de OVJ zien. Met behulp van de ultrasound machine software, het verkrijgen van snelheidsmetingen precies op de OVJ.
Opmerking: Als de hartslag van een embryo afneemt tijdens de beeldvorming, moet aldus verkregen snelheid gegevens niet worden gebruikt voor analyse. Alle embryo's die voor snelheidsmetingen bij voorkeur niet worden gebruikt voor andere experimenten na echografie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Weergegeven in figuur 1 zijn aanbevolen nodige instrumenten OFT verbinden. De petrischaal (figuur 1A) die de embryo ex ovo moeten diep genoeg zijn om het embryo niet vernietigen na met het deksel. Diepe petrischalen (figuur 1C), te worden gebruikt voor ultrageluid beeldvorming om een voldoende volume buffer Tyrode bovenop de dooier te gieten.
Een enkele 1 cm draad (Figuur 2A) wordt tweezed uit van een 11/0 nylon hechtdraad (figuur 1A) en gebonden in een losse knot (Figuur 1B). Alle voorgevormde knoesten zijn UV gesteriliseerd. Figuur 3A toont een vochtig gemaakte kamer waar rocker bevruchte kippeneieren worden geïncubeerd totdat de gewenste fase. Figuur 3B toont een embryo incubator, waar de gestreepte en controle embryo's worden gehandhaafd ex ovo
Figuur 4A een HH17 embryo bovenop de dooier ex ovo. Figuur 4B is een schematische weergave die de positie van de hechtdraad (band) en OVJ van een HH17 embryo. Figuur 4C is een representatief beeld van een gestreepte embryo afgebeeld 48 uur na de operatie.
Het effect van de strepen interventie bloedstroomsnelheid door de vernauwing plaats wordt gemeten door middel van 2D echografie. Zoals verwacht, de snelheid van de OVJ hoger in de gestreepte embryo opzichte van de controle (Figuur 5). We hebben onlangs uitgevoerd computational fluid dynamics analyse (CFD) op gestreepte en controle harten van de 24 hr tijdstip waarop de effecten van de OFT strepen op de snelheid van de bloedstroom en shear stress-17.
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figuur 1. chirurgische instrumenten. (A) 11/0 nylon hechtdraad. (B) Petri plaat met voorgevormde knopen. (C) Deep petrischaal voor ex ovo embryo cultuur en echografie. (D) Transfer pipet. (E) scalpel omgaan met de eischaal te kraken. (F) Straight schaar voor embryo uitsnijding voor post-chirurgie studies. (G) Fine pincet klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Suture voor OFT Banding. (A) Een enkel 1 cm draad tweezed uit een hechtdraad.
Figuur 3. Incubation Chambers. (A) Bevochtigde rocker incubator voor bevruchte eieren. (B) vochtige kamer voor ex ovo cultuur van gestreepte en controle embryo's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. OFT Banding. (A) Hele HH17 kippenembryo onderhouden ex ovo, schaal bar = 10 mm (B) Schematische weergave die de vernauwingwebsite (rood). (C) De gestreepte embryo afgebeeld 48 uur na OFT banding, schaal bar = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Ultrasound-afgeleide snelheidsmetingen. Vertegenwoordiger snelheidsprofielen van (A) controle en (B) gestreepte embryo's behaald aan een 1 uur tijdstip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze techniek is relatief snel en eenvoudig uit te voeren, moet echter een aantal belangrijke punten in gedachten worden gehouden om zo nauwkeurig downstream resultaten te krijgen. Embryo's worden gehandhaafd ex ovo in een petrischaaltje dat Tyrode buffer bevat om adequate rehydratatie verschaffen. Het is ook belangrijk om de dooier na de operatie met buffer Tyrode hydrateren en te zorgen dat de incubatiekamer adequaat gehydrateerd. Operaties niet worden uitgevoerd op embryo eventuele bloeden zichtbaar of de dooier zelfs iets gebroken. Dit beïnvloedt embryo overleving, vooral voor langdurige experimenten. Een andere mogelijke oorzaak van de dodelijkheid om embryo's, is de vraag of de band rond de OFT is te strak wanneer het eerst toegepast, waardoor aanzienlijk afbreuk te doen aan de hartfunctie.
Momenteel gebruiken we ultrageluid als bevestigingsmethode instrument om de verandering in snelheid van de bloedstroom te bepalen op OFT banding. In de toekomst zullen we bevestigen met behulp van micro-computertomografie (CT). We hebben ook visueel bepalen de band strakheid rond de OFT in de B-modus 2D-beelden. Belangrijk, geen verschillen in hartslag en volumestroom (berekend met CFD) worden waargenomen tussen embryo's in de gestreepte en controlegroepen 17. Deze geven aan dat de fysiologie van het cardiovasculaire systeem wordt gelicht ten gestreepte embryo en zo te valideren van de banding interventie.
Op het gewenste tijdstip na het verbinden meerdere analyses kunnen worden uitgevoerd om het effect van het veranderde hemodynamica bij kritische klep ontwikkelingsprocessen begrijpen. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het bepalen van veranderingen in transcriptniveaus belangrijke regulerende genen betrokken bij ventiel ontwikkeling, het bepalen lokalisatie van ECM componenten en het bepalen van de ultrastructuur van de OFT.
Tenslotte, deze techniek verbetert de huidige methode van het OFT strepen in het embryo in het ei 19 vensters. Die methode is ernstigly belemmerd door het onvermogen om noodzakelijke embryo accumuleren stroomafwaartse moleculaire analyses doen. Deze nieuwe techniek kan worden gebruikt rescue experimenten ook. Deze applicatie maakt het mogelijk om OFT geringd worden gered van en embryo toegestaan om te herstellen van de belediging. Geen huidige methode kan dit doen en nog steeds in staat zijn om statistisch significante downstream-analyses uit te voeren.
We hebben met succes deze techniek gebruikt om de hemodynamische stimuli in het hart van kippenembryo's in een zeer vroeg ontwikkelingsstadium (HH 16-17) te wijzigen. Het verbinden protocol kan een uitdaging bij het uitvoeren van de chirurgie in latere ontwikkelingsstadia vanwege het risico van insnijden een van de extra-embryonale bloedvaten. Ook in late stadia van ontwikkeling, is het vaak moeilijk de dooierzak intact wanneer de ei-inhoud wordt overgebracht in de petrischaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S.
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
