Protocol
embryons aviaires ne sont pas considérés comme des animaux vertébrés en vertu des règlements IUCAC.
1. Obtenir Embryons pour la chirurgie
- Incuber 80 - 90 fécondés des œufs de poule Bovan (extrémités franches de haut) dans un humidifié (60%) rocker incubateur à 40 ° C pendant environ 72 heures pour obtenir des embryons à Hamilton et Hamburger (HH) étape 17. Déterminer le nombre exact d'oeufs sur la base analyse de puissance et le taux d'embryons 17 de survie. Utiliser des plateaux d'œufs en plastique pour l'incubation pour permettre la circulation d'air suffisante.
- Une fois que ce stade de développement souhaité est atteint, verser environ 20 ml (37 ° C) tampon chaud Tyrode (supplémenté avec du bicarbonate de sodium (1 g / L)) dans un 100 mm x 26 mm boîte de Pétri.
- Stériliser une coquille d'œuf avec 70% d'éthanol.
- casser délicatement la coquille avec une poignée de scalpel et relâcher soigneusement son contenu dans le plat contenant du tampon de Tyrode. Jeter les embryons (i) si elles apparaissent visuellement anormale (ii) ilsne sont pas au stade de développement à droite (iii) ils sont mal orientés sur le jaune et / ou (iv) un saignement se produit. Conservez tous les embryons non soumis à une intervention chirurgicale immédiatement après avoir été placé ex ovo à 40 ° C afin de ne pas compromettre le développement.
Note: Staging est effectuée sur la base de Hamilton et Hamburger 18. Anormalité d'embryons de poulet est déterminé par l'oeil nu et dans le champ de dissection. Veiller à ce que l'embryon a le pliage approprié et à la flexion et de la vascularisation.
2. OFT Banding
- Tweeze sur chaque 1 cm de longs fils d'une seule suture chirurgicale 11/0 en nylon et former un noeud lâche. UV stériliser tous les noeuds préformés.
- Sous un microscope de dissection, assurer visuellement que le cœur bat à un rythme normal (~ 120 battements / min). Sinon, jetez l'embryon.
- Juste avant la chirurgie, appliquer 5 - 6 ml de (C 37 °) tampon chaud Tyrode à la surface de l'embryon à l'aide d'une pipette de transfert.
- Passez une extrémité libre du noeud préformé sous l'OFT, positionner le fil de suture à l'OFT / ventricule jonction (OVJ) (ou l'emplacement désiré), et passer l'extrémité libre dans le noeud constriction ainsi l'OFT, y compris les membranes entourant le cœur.
- Après la chirurgie, mouiller la surface du jaune d'oeuf avec 5 - 6 ml d'une chaude (37 ° C) du tampon de Tyrode à l'aide d'une pipette de transfert.
- Maintenir les embryons de contrôle ex ovo que les embryons bagués; mais ne pas les soumettre à la procédure chirurgicale.
- Incuber les embryons, pour la durée désirée, à 40 ° C dans un (60%) incubateur humidifié.
- Une fois le point de temps désiré est atteint, exciser l'embryon du jaune à l'aide des ciseaux droits. Disséquer le cœur avec une pince fine et utiliser pour plusieurs études en aval tels que les changements dans la morphologie cardiaque due à l' hémodynamique modifiée 17.
3. Confirmant que l'intervention de baguage provoque un changement dans hémodynamique
Remarque: le rétrécissement partiel provoquée par l'intervention de cerclage conduit à une augmentation de la vitesse d'écoulement du sang à l'OVJ. Ce paramètre hémodynamique est commodément déterminée en utilisant l'imagerie par échographie 2D, qui est effectuée au niveau du point de temps désiré de l'expérience.
- Etant donné que seulement un seul embryon peut être imagée à la fois, maintenir tous les autres embryons désignés pour l'imagerie par ultrasons dans un incubateur à 40 °.
- Placez la boîte de Pétri contenant l'embryon à imager sur un coussin chauffant à 40 ° C.
- Remplissez le plat, jusqu'au bord, avec un tampon chaud (37 ° C) Tyrode. Verser lentement la solution tampon dans le plat de manière à maintenir le jaune intact. Cependant, si l'intégrité du jaune d'oeuf est compromise au cours de cette étape, éliminer l'embryon.
- Orienter l'embryon de telle sorte que l'axe central de l'embryon est perpendiculaire à la sonde à ultrasons qui est suspendu à partir d'un support réglable.
- Avec l'opéra de machine à ultrasonsting en mode B, obtenir une image 2D du cœur battant à l'écran et déplacer la scène (coussin chauffant) de telle sorte que l'OFT, ventricule et OVJ sont clairement visibles.
- Passez en mode pulsé onde (PW), à la fréquence de répétition d'impulsion souhaitée (par exemple, 20 kHz) et d' obtenir des données de vitesse exactement au OVJ. Une image en mode B du cœur battant est obtenu sur l'écran.
- Déplacer la scène pour voir l'OFT, le ventricule et l'OVJ. Utilisation du logiciel de la machine à ultrasons, d'obtenir des mesures de vitesse exactement au OVJ.
Remarque: Si le taux d'un embryon cardiaque diminue lors de l'imagerie, les données de vitesse ainsi obtenues ne doivent pas être utilisés pour l'analyse. Tous les embryons utilisés pour des mesures de vitesse doivent de préférence être utilisés pour d'autres expériences après l'imagerie par ultrasons.
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Representative Results
Montré dans la figure 1 sont des instruments nécessaires pour le baguage OFT recommandé. La boîte de Pétri (figure 1A) contenant l'embryon ex ovo doit être assez profond pour ne pas détruire l'embryon lorsqu'il est recouvert avec le couvercle. Des boîtes de Pétri profondes (figure 1c) doivent également être utilisés pour l' imagerie par ultrasons afin de permettre à un volume suffisant de tampon de Tyrode à couler au - dessus du jaune d' oeuf.
Un seul 1 cm fil (figure 2A) est tweezed à partir d' un 11/0 suture en nylon (figure 1A) et attaché dans un noeud lâche (figure 1B). Tous les noeuds préformés sont stérilisées UV. La figure 3A montre une chambre à bascule humidifié où des œufs de poule fertilisés sont incubés jusqu'au stade désiré. La figure 3B montre un incubateur d'embryons, où bagués et embryons de contrôle sont maintenus ex ovo
Montré dans la figure 4A est un embryon de HH17 au - dessus du jaune ex ovo. La figure 4B est une représentation schématique montrant la position de la suture (bande) à l'OVJ d'un embryon HH17. Figure 4C est une image représentative d'un embryon bagués imagé 48 heures après la chirurgie.
L'effet de l'intervention de banderolage de la vitesse du flux sanguin à travers le site de restriction est mesuré par imagerie à ultrasons 2D. Comme prévu, la vitesse à la OVJ est plus élevée dans l'embryon en bande par rapport au témoin (figure 5). Nous avons récemment effectué la dynamique des fluides (CFD) analyse computationnelle sur des coeurs bagués et de contrôle au point de temps de 24 heures montrant les effets de bandes OFT sur la vitesse d'écoulement du sang et de la paroi contrainte de cisaillement 17.
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Figure 1. Instruments chirurgicaux. (A) de suture 11/0 en nylon. (B) de la plaque de Pétri contenant des noeuds préformés. (C) de boîte de Pétri profonde pour la culture d'embryons ex ovo et l' imagerie par ultrasons. (D) Transfert pipette. (E) poignée Scalpel pour casser la coquille d'oeuf. (F) ciseaux droits pour l' embryon excision pour les études post-chirurgie. (G) une pince fine S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Suture pour OFT baguage. (A) Un seul fil de 1 cm tweezed à partir d' une suture.
Figure 3. Incubation Chambers. (A) humidifié incubateur à bascule pour les œufs fécondés. (B) de la chambre humidifié pour ex ovo culture d'embryons bagués et de contrôle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. OFT baguage. (A) Whole HH17 embryon de poulet maintenu ex ovo, barre d'échelle = 10 mm (B) Représentation schématique illustrant la constriction( en rouge). (C) Banded embryon imagé 48 heures après le baguage OFT, barre d'échelle = 0,5 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Ultrasound-dérivé Mesures de vélocité. Profils de vitesse représentant de (A) le contrôle et (B) bagués embryons obtenus à un point de temps de 1 heure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cette technique est relativement rapide et facile à réaliser, mais certains points clés doivent être gardés à l'esprit afin d'obtenir des résultats précis en aval. Les embryons doivent être maintenus ex ovo dans une boîte de Pétri contenant du tampon de Tyrode pour fournir une réhydratation adéquate. Il est également important d'hydrater le jaune post-opératoire avec le tampon de Tyrode et assurez-vous que la chambre d'incubation est suffisamment hydratée. Chirurgies ne doivent pas être effectuées sur un embryon, si tout saignement est visible ou le jaune est même légèrement cassé. Cela affecte la survie des embryons, en particulier pour les expériences à long terme. Une autre cause potentielle de létalité à des embryons, est de savoir si la bande autour de l'OFT est trop serré lors de la première application, compromettant ainsi significativement la fonction cardiaque.
À l'heure actuelle, nous utilisons l'échographie comme outil de confirmation afin de déterminer la variation de la vitesse d'écoulement de sang sur le baguage OFT. À l'avenir, nous allons confirmer avec micro-tomodensitométrie (CT). Nous avons également de déterminer visuellement la bande étanchéité autour de l'OFT en mode B des images 2D. Surtout, aucune différence dans la fréquence cardiaque et le débit volumétrique (calculé en utilisant CFD) sont observées entre les embryons dans les groupes bagués et de contrôle 17. Ceux-ci indiquent que la physiologie du système cardio-vasculaire ne soit pas compromise dans les embryons rubanées, validant ainsi encore l'intervention de cerclage.
Au point de temps désiré, après le baguage, plusieurs analyses peuvent être effectuées pour comprendre l'effet de l'hémodynamique modifiés sur les processus de développement de la vanne critique. Ceux-ci comprennent, mais sans s'y limiter, la détermination des changements dans les niveaux de gènes régulateurs clés impliqués dans le développement de la soupape de transcription, la détermination de la localisation des composants de l'ECM et la détermination de l'ultrastructure de l'OFT.
Enfin, cette technique améliore la méthode actuelle de baguage l'OFT dans l'embryon dans l'œuf fenêtré 19. Cette méthode est sévèrement entravée par l'incapacité d'accumuler des embryons nécessaires pour faire des analyses moléculaires en aval. Cette nouvelle technique peut être utilisée dans des expériences de sauvetage aussi bien. Cette application permet la bagué OFT d'être secourus et des embryons autorisés à se remettre de l'insulte. Aucune méthode actuelle peut le faire et toujours être en mesure d'effectuer des analyses en aval statistiquement significatives.
Nous avons utilisé avec succès cette technique pour modifier les stimuli hémodynamiques dans le cœur de l'embryon de poulet à un stade très précoce de développement (HH 16 - 17). Le protocole de baguage pourrait présenter un défi lors de l'exécution de la chirurgie à des stades ultérieurs de développement en raison du risque d'entailler l'un des vaisseaux sanguins extraembryonnaires. En outre, à un stade avancé de développement, il est souvent difficile de garder le jaune sac intact lorsque le contenu d'œufs sont transférés dans la boîte de Pétri.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S.
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
