Protocol
एवियन भ्रूण IUCAC नियमों के तहत कशेरुकी जीवों नहीं माना जाता है।
1. सर्जरी के लिए भ्रूण प्राप्त
- 80 सेते हैं - लगभग 72 घंटा हैमिल्टन और हैम्बर्गर (एच एच) चरण में भ्रूण प्राप्त करने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified (60%) घुमाव इनक्यूबेटर में 90 निषेचित Bovan चिकन अंडे (कुंद अंत तक) 17. के आधार पर अंडे की सही संख्या का निर्धारण बिजली विश्लेषण और भ्रूण 17 के जीवित रहने की दर। ऊष्मायन के लिए प्लास्टिक अंडे की ट्रे का उपयोग पर्याप्त हवा परिसंचरण की अनुमति है।
- एक बार जब यह वांछित विकास मंच उपलब्ध हो जाता है, एक 100 मिमी x 26 मिमी पेट्री डिश में लगभग 20 मिलीलीटर गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) Tyrode के बफर (सोडियम बाइकार्बोनेट (1 जी / एल) के साथ पूरक) की डालना।
- 70% इथेनॉल के साथ एक अंडे के खोल जीवाणुरहित।
- धीरे एक छुरी संभाल के साथ खोल दरार और ध्यान से Tyrode के बफर युक्त डिश में इसकी सामग्री जारी। त्यागें अगर भ्रूण (i) वे नेत्रहीन दिखाई असामान्य (ii) वेसही विकास के चरण में (iii) वे अनुचित तरीके से की जर्दी और / या (iv) किसी भी खून बह रहा होता है पर केंद्रित कर रहे हैं नहीं कर रहे हैं। तुरंत बाद 40 डिग्री सेल्सियस पर ओवो पूर्व रखा जा रहा है ताकि के रूप में विकास से समझौता नहीं करने के लिए सर्जरी के अधीन नहीं किसी भी भ्रूण को बनाये रखें।
नोट: मचान हैमिल्टन और हैम्बर्गर 18 के आधार पर किया जाता है। लड़की भ्रूण में असामान्यता नग्न आंखों से और विच्छेदन दायरे के तहत चुना गया है। सुनिश्चित भ्रूण उचित तह और झुकने और वाहिका है।
2. ओ एफ टी बैंडिंग
- एक भी 11/0 नायलॉन सर्जिकल सिवनी से व्यक्तिगत 1 सेमी लंबे धागे बाहर tweeze और एक ढीला गाँठ के रूप में। यूवी सभी preformed समुद्री मील बाँझ।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, नेत्रहीन सुनिश्चित करना है कि दिल एक सामान्य दर (~ 120 धड़क रहा है / मिनट) में धड़क रहा है। यदि नहीं, तो भ्रूण त्यागें।
- भ्रूण सतह एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करने के लिए गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) Tyrode के बफर के 6 मिलीलीटर - सिर्फ सर्जरी से पहले, 5 लागू होते हैं।
- ओ एफ टी के तहत preformed गाँठ से एक मुक्त अंत दर्रा, ओ एफ टी / वेंट्रिकल जंक्शन (OVJ) (या इच्छित स्थान) पर सिवनी की स्थिति, और गाँठ जिससे दिल के आसपास झिल्ली सहित ओ एफ टी बाधा में मुक्त अंत से गुजरती हैं।
- गर्म के 6 मिलीलीटर (37 डिग्री सेल्सियस) Tyrode के बफर एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग - सर्जरी के बाद, 5 के साथ की जर्दी की सतह गीला।
- नियंत्रण भ्रूण बंधी भ्रूण के रूप में पूर्व ओवो बनाए रखना; हालांकि उन्हें शल्य प्रक्रिया के अधीन नहीं है।
- एक humidified (60%) इनक्यूबेटर में भ्रूण सेते हैं, समय के वांछित राशि के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर।
- एक बार इच्छित समय बिंदु तक पहुँच जाता है, जर्दी सीधे कैंची का उपयोग करने से भ्रूण आबकारी। ठीक संदंश के साथ दिल काटना और इस तरह बदल hemodynamics 17 के कारण हृदय की आकृति विज्ञान में परिवर्तन के रूप में कई बहाव के अध्ययन के लिए इस्तेमाल करते हैं।
3. पुष्टि है कि बैंडिंग हस्तक्षेप hemodynamics में बदलाव का कारण बनता
नोट: आंशिक बैंडिंग हस्तक्षेप की वजह से कसना OVJ में रक्त प्रवाह वेग में वृद्धि हो जाती है। इस रक्तसंचारप्रकरण पैरामीटर आसानी से 2 डी अल्ट्रासाउंड इमेजिंग, जो प्रयोग के वांछित समय बिंदु पर किया जाता है का उपयोग कर मूल्यांकन किया है।
- चूंकि केवल एक ही भ्रूण एक समय में imaged किया जा सकता है, अन्य सभी एक 40 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए नामित भ्रूण बनाए रखें।
- जगह पेट्री डिश भ्रूण युक्त एक हीटिंग पैड 40 डिग्री सेल्सियस पर सेट पर imaged किया जा सके।
- डिश भरें, सीमा से ऊपर, गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) Tyrode के बफर के साथ। धीरे-धीरे डिश में बफर समाधान डालना इतनी के रूप में की जर्दी बरकरार रखने के लिए। अगर, हालांकि, जर्दी की अखंडता को इस कदम के दौरान समझौता किया है, भ्रूण त्यागें।
- ओरिएंट भ्रूण ऐसी है कि भ्रूण की केंद्रीय धुरी अल्ट्रासाउंड जांच जो एक समायोज्य स्टैंड से निलंबित कर दिया है करने के लिए खड़ा है।
- अल्ट्रासाउंड मशीन ओपेरा के साथबी मोड में टिंग, स्क्रीन पर दिल की धड़कन की एक 2 डी छवि प्राप्त और मंच (हीटिंग पैड) को स्थानांतरित ऐसी है कि बहुधा, वेंट्रिकल और OVJ स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं।
- स्पंदित-लहर (पीडब्लू) मोड में स्विच करें, इच्छित नाड़ी पुनरावृत्ति आवृत्ति (जैसे, 20 kHz) पर और OVJ पर बिल्कुल वेग डेटा प्राप्त करते हैं। दिल की धड़कन का एक बी मोड छवि स्क्रीन पर प्राप्त की है।
- बहुधा, वेंट्रिकल और OVJ देखने के लिए मंच ले जाएँ। अल्ट्रासाउंड मशीन सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, बिल्कुल OVJ पर वेग माप प्राप्त करते हैं।
नोट: एक भ्रूण के दिल की दर इमेजिंग के दौरान कम हो जाती है, तो वेग डेटा इस प्रकार प्राप्त विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। वेग मापन के लिए इस्तेमाल सभी भ्रूण अधिमानतः अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के बाद किसी भी अन्य प्रयोगों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए।
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Representative Results
चित्र 1 में दिखाया ओ एफ टी बैंडिंग के लिए आवश्यक उपकरणों की सिफारिश की है। पेट्री डिश (चित्रा 1 ए) भ्रूण पूर्व युक्त ओवो के रूप में तो भ्रूण जब ढक्कन के साथ कवर को नष्ट नहीं करने के लिए पर्याप्त गहरा किया जाना चाहिए। दीप पेट्री डिश (चित्रा 1 सी) भी Tyrode के बफर की पर्याप्त मात्रा की जर्दी के ऊपर डाला जा करने के लिए अनुमति देने के लिए अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
एक एकल 1 सेमी धागा (2A चित्रा) एक 11/0 नायलॉन सीवन (चित्रा 1 ए) से बाहर tweezed जाता है और एक ढीला गाँठ (चित्रा 1 बी) में बंधे। सभी preformed समुद्री मील यूवी निष्फल रहे हैं। चित्रा 3A एक humidified घुमाव कक्ष जहां निषेचित अंडे चिकन वांछित चरण तक incubated रहे हैं पता चलता है। चित्रा 3 बी एक भ्रूण इनक्यूबेटर, जहां बंधी और नियंत्रण भ्रूण ओवो पूर्व रखा जाता है पता चलता है
चित्रा -4 ए में दिखाया गया है जर्दी पूर्व ओवो। चित्रा 4 बी के शीर्ष पर एक HH17 भ्रूण एक योजनाबद्ध एक HH17 भ्रूण के OVJ पर सिवनी (बैंड) की स्थिति दिखा प्रतिनिधित्व है। चित्रा 4C imaged एक बंधी भ्रूण के एक प्रतिनिधि छवि है सर्जरी के बाद 48 घंटा।
कसना साइट के माध्यम से रक्त प्रवाह वेग पर बैंडिंग हस्तक्षेप का असर 2 डी अल्ट्रासाउंड इमेजिंग द्वारा मापा जाता है। जैसी कि उम्मीद थी, OVJ पर वेग बंधी भ्रूण नियंत्रण (चित्रा 5) के सापेक्ष में अधिक है। हमने हाल ही में 24 घंटा समय ओ एफ टी रक्त प्रवाह वेग और दीवार कतरनी तनाव 17 पर बैंडिंग का प्रभाव दिखा बिंदु पर प्रदर्शन किया कम्प्यूटेशनल फ्लूड डायनामिक्स (सीएफडी) बंधी और नियंत्रण दिलों पर विश्लेषण।
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चित्रा 1. सर्जिकल उपकरण। (ए) 11/0 नायलॉन सीवन। (बी) पेट्री पूर्व गठित समुद्री मील युक्त थाली। (सी) पूर्व ओवो भ्रूण संस्कृति और अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के लिए दीप पेट्री डिश। (डी) हस्तांतरण पिपेट। (ई) स्केल्पल अंडे का खोल दरार करने के लिए संभाल। (एफ) के बाद सर्जरी की पढ़ाई के लिए भ्रूण छांटना के लिए सीधे कैंची। (G) ठीक संदंश यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2 ओ एफ टी बैंडिंग के लिए सिवनी। (ए) एक एकल 1 सेमी धागा एक सिवनी से बाहर tweezed।
चित्रा 3. ऊष्मायन कक्षों। (ए) निषेचित अंडे के लिए humidified इनक्यूबेटर घुमाव। (बी) बंधी और नियंत्रण भ्रूण की संस्कृति ओवो पूर्व के लिए humidified कक्ष। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. ओ एफ टी बैंडिंग। (ए) पूरे HH17 लड़की भ्रूण पूर्व ओवो बनाए रखा, पैमाने बार = 10 मिमी (बी) योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व कसना चित्रणसाइट (लाल)। (सी) बंधी भ्रूण ओ एफ टी बैंडिंग के बाद 48 घंटा imaged, पैमाने बार = 0.5 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वेग माप चित्रा 5. अल्ट्रासाउंड-निकाली गई। (ए) नियंत्रण और (बी) के प्रतिनिधि वेग प्रोफाइल एक 1 घंटा समय बिंदु पर प्राप्त भ्रूण बंधी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस तकनीक अपेक्षाकृत जल्दी और प्रदर्शन करने के लिए आसान है, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं को ध्यान में रखा जाना करने के लिए इतनी के रूप में सही बहाव के परिणाम प्राप्त करने की जरूरत है। भ्रूण एक पेट्री डिश है कि Tyrode के बफर पर्याप्त पुनर्जलीकरण प्रदान करने के लिए होता है में ओवो पूर्व बनाए रखा जाना चाहिए। यह भी महत्वपूर्ण है Tyrode के बफर के साथ की जर्दी के बाद सर्जरी हाइड्रेट करने के लिए और यकीन है कि ऊष्मायन कक्ष पर्याप्त रूप से हाइड्रेटेड है बना है। सर्जरी एक भ्रूण पर नहीं किया जाना चाहिए अगर किसी भी खून बह दिखाई दे रहा है या जर्दी भी थोड़ा टूट गया है। यह विशेष रूप से लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए, भ्रूण अस्तित्व को प्रभावित करता है। भ्रूण को मारक का एक अन्य संभावित कारण है, चाहे ओ एफ टी के आसपास बैंड भी तंग है जब पहली बार, लागू इस प्रकार काफी हृदय समारोह समझौता किए है।
वर्तमान में, हम बार बार बैंडिंग पर रक्त प्रवाह वेग में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए एक उपकरण के रूप में पुष्टि अल्ट्रासाउंड का उपयोग करें। भविष्य में, हम सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी का उपयोग कर पुष्टि करेगा (सीटी)। हम यह भी नेत्रहीन बी मोड 2 डी छवियों में ओ एफ टी के आसपास बैंड तंगी का निर्धारण। महत्वपूर्ण बात है, हृदय गति और बड़ा प्रवाह (सीएफडी का उपयोग कर गणना) में कोई मतभेद नहीं बंधी और नियंत्रण समूहों 17 में भ्रूण के बीच मनाया जाता है। ये संकेत मिलता है कि हृदय प्रणाली के शरीर क्रिया विज्ञान बंधी भ्रूण में समझौता नहीं किया है, इस प्रकार आगे बैंडिंग हस्तक्षेप मान्य।
वांछित समय बिंदु पर, बैंडिंग के बाद, कई विश्लेषण महत्वपूर्ण वाल्व विकास की प्रक्रिया पर बदल hemodynamics के प्रभाव को समझने के लिए किया जा सकता है। इनमें शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, कुंजी नियामक वाल्व विकास में शामिल जीन की प्रतिलिपि के स्तर में परिवर्तन का निर्धारण करने, ईसीएम घटकों के स्थानीयकरण का निर्धारण करने और बार बार की फैटी निर्धारण।
अंत में, इस तकनीक विंडोड अंडा 19 के अंदर भ्रूण में ओ एफ टी बैंडिंग की वर्तमान पद्धति पर सुधार। यही कारण है कि विधि गंभीर हैLy असमर्थता द्वारा बाधा उत्पन्न आवश्यक भ्रूण जमा करने के लिए नीचे की ओर आणविक विश्लेषण करने के लिए। इस नई तकनीक के रूप में अच्छी तरह से बचाव के प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह आवेदन ओ एफ टी बंधी बचाया जा करने के लिए और भ्रूण अपमान से उबरने के लिए अनुमति देता है। कोई मौजूदा विधि इस करते हैं और अभी भी सांख्यिकीय महत्वपूर्ण बहाव के विश्लेषण प्रदर्शन करने में सक्षम हो सकता है।
हम सफलतापूर्वक इस तकनीक कार्यरत है एक बहुत ही प्रारंभिक विकास मंच (एचएच 16 - 17) पर लड़की भ्रूण के दिल में रक्तसंचारप्रकरण उत्तेजनाओं बदलने के लिए। बैंडिंग प्रोटोकॉल extraembryonic रक्त वाहिकाओं के किसी भी nicking के जोखिम के कारण जब विकास के बाद के चरणों में सर्जरी प्रदर्शन एक चुनौती पेश कर सकता है। इसके अलावा, विकास की देर चरणों में, यह अक्सर मुश्किल बरकरार थैली की जर्दी रखने के लिए जब अंडा सामग्री पेट्री डिश में स्थानांतरित कर रहे है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
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