Isolering och karakterisering av en huvud- och hals skivepitelcancer subpopulation med stamcells Egenskaper
Summary
Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
Abstract
Trots framsteg i förståelsen av huvud och hals skivepitelcancer (HNSCC) progression, förblir den femåriga överlevnaden låg på grund av lokalt återfall och fjärrmetastaser. En hypotes för att förklara detta återfall är närvaron av cancer stamceller liknande celler (CSCS) som presenterar inneboende kemo- och radioresistens. För att utveckla nya behandlingsstrategier, är det nödvändigt att ha experimentella modeller som validerar effektiviteten av riktade behandlingar och därmed ha tillförlitliga metoder för identifiering och isolering av CSCs. För detta ändamål, presenterar vi ett protokoll för isolering av CSCs från HNSCC cellinjer mänskliga som bygger på en kombination av två på varandra följande cellsorteringar utförs av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Den första är baserad på egenskapen av CSCs att överuttrycka ATP-bindande kassett (ABC) transportproteiner och därmed utesluta, bland andra, viktiga DNA-färgämnen såsom Hoechst 33342. Cellerna sorteras med thär metoden identifieras som en "sido population" (SP). Eftersom SP celler representerar en låg andel (<5%) av modercellerna, är det nödvändigt med en växande fas i syfte att öka deras antal före den andra cellsortering. Nästa steg möjliggör selektion av celler som besitter två andra egenskaper HNSCC stamcells dvs höga expressionsnivån av den cellytmarkör CD44 (CD44 hög) och den överuttryck av aldehyddehydrogenas (ALDH hög). Eftersom användningen av en enda markör har många begränsningar och fallgropar för isolering av CSCs, kombinationen av SP, kommer CD44 och ALDH markörer ge ett användbart verktyg för att isolera CSCs för ytterligare analytiska och funktionella analyser som kräver livskraftiga celler. Stjälkliknande egenskaper CSCs slutligen validerat in vitro genom bildandet av tumorispheres och uttrycket av β-catenin.
Introduction
Huvud och hals skivepitelcancer (HNSCC) är en vanlig malignitet hela världen och trots framsteg i dagens behandlingar, patienter med avancerad sjukdom har en dålig prognos. Den totala 5 års överlevnad för patienten är cirka 30% trots kombination av terapeutiska metoder, bland annat kirurgi, kemoradioterapi och riktade-behandlingar. Nyligen genomförda studier attribut lokalt återfall och fjärrmetastaser för överlevnaden av cancer stamceller-liknande celler (CSCs) efter cancerbehandling 1. Det finns ackumulerande bevis för förekomsten av celler som presenterar stamceller egenskaper (odifferentierad statussjälvförnyelse och differentiering kapacitet, och telomerasaktivitet) i olika solida tumörer inklusive bröst, hjärna, prostata, lunga, kolon, bukspottkörtel, lever och hud 2- 10. Dock kvarstår ursprung CSCs oklar 11,12. De kan bero på malign transformation av normala stamceller 3,13 eller dedifferenfinfördelning på djupet av tumörceller som förvärvar CSCs liknande funktioner 14,15. Därför kommer förstå distinkta vägar i samband med CSCs ge insikt i tidig diagnos och behandling av resistent HNSCC.
Det har föreslagits att CSCs besitter också resistenta fenotyper som undviker standard kemoterapi och radioterapi, vilket resulterar i tumör återfall jämfört med huvuddelen av tumörcellerna 16-19 och är lokaliserade i hypoxisk nischer 20. Ett stort antal faktorer har föreslagits för att förklara dessa resistanser CSCs, såsom benägenhet till inaktivitet, förbättrad DNA-reparation, uppreglerat cellcykel kontrollmekanismer och fria radikaler 21. Dessutom kan flera onkogena molekylära vägar specifikt aktiveras i CSCs 17. För att förbättra kunskapen om CSCs för ytterligare riktade-behandlingar, vi behöver tillförlitliga metoder för identifiering och isolering av CSCs, på grund av heterogenitet stamcellsrelaterade markörer iolika typer av cancer 22.
I HNSCC, stam-liknande tumör initierande celler har isolerats från primär patientens tumörer genom att sortera celler som uttrycker olika CSC biomarkörer (t.ex. läkemedelsflödes transportörer uttryck 23, CD44 hög, CD24 låg CD133 hög, c-Met -fenotyp 10,24, 25, eller ALDH hög aktivitet 26) eller odla primära patienten tumör att bilda squamospheres som har CSC egenskaper. Ändå har antalet squamospheres minskar dramatiskt efter två passager, vilket ger en liten provstorlek för ytterligare karakterisering studerar 27. Därför in vitro-analyser med utgångspunkt från väletablerade cellinjer är en enklare lösning att utforma experiment för att förbättra kunskapen om CSCs.
Syftet med denna artikel är att föreslå en metod för att isolera CSCs från HNSCC cellinjer med hjälp av multiparameter flödescytometrisk analys ennd cellsortering. Uttrycket av CD44 i samband med flera CSCs egenskaper inklusive ALDH aktivitet, Side Befolkning (SP) fenotyp, sfäroid formation förmåga och tumörbildning användas för att isolera och karaktärisera denna undergrupp av CSCs. CD44, en cellytan glykoprotein, är involverad i celladhesion och migration. CD44 uttrycks starkt i många solida tumörer CSCs 28, bland annat i huvud- och halscancermodeller 29-31. Dessutom kan CD44 höga celler genererar in vivo en heterogen tumör medan CD44 låg celler kan inte 10. SP analysen är baserad på den differentiella potentialen av celler till utflödes Hoechst färgämne 22 via den ATP-bindande kassett (ABC) familjen av transportproteiner överuttrycks inom CSC membranet. Denna analys innefattar användningen av ABC-transporthämmare såsom verapamil i kontrollprover. Aldehyddehydrogenas (ALDH) är en intracellulär enzym som är involverat i att omvandla retinol att retinoic syra under tidig stamcellsdifferentiering 25,26. Celler som uppvisar hög ALDH-aktivitet show stem-liknande cellbeteende i HNSCC 26 och ett mycket få antal ALDH höga celler kan generera tumörer in vivo 26,32.
Kombinationen av dessa markörer och egenskaper har med framgång använts av Bertrand e t al. För att studera resistens in vitro och in vivo av dessa CSCs foton och kol joniserad strålning 19. Deras resultat visade tydligt att kombinationen av olika cellmarkörer och egenskaper är mer selektiva för användbara studier på HNSCC CSCS populationer än en enda markör metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för att framgångsrikt isolera CSCs från en specifik cellinje som är tillämpbar på andra HNSCC cellinjer. Isolerade huvud- och hals CSCs lämpar sig sedan för ytterligare molekylär karakterisering in vitro och funktionell validering av transplantation i immundefekta möss 19. Dock kan vissa modifieringar testas beroende på den sida populationen eller de CD44 hög / ALDH höga procentandelar som är närvarande i den paren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |
References
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells — Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells — Normal stem cells ‘Jedi’ that went over to the ‘dark side.’. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma–derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. . Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
