Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
Trots framsteg i förståelsen av huvud och hals skivepitelcancer (HNSCC) progression, förblir den femåriga överlevnaden låg på grund av lokalt återfall och fjärrmetastaser. En hypotes för att förklara detta återfall är närvaron av cancer stamceller liknande celler (CSCS) som presenterar inneboende kemo- och radioresistens. För att utveckla nya behandlingsstrategier, är det nödvändigt att ha experimentella modeller som validerar effektiviteten av riktade behandlingar och därmed ha tillförlitliga metoder för identifiering och isolering av CSCs. För detta ändamål, presenterar vi ett protokoll för isolering av CSCs från HNSCC cellinjer mänskliga som bygger på en kombination av två på varandra följande cellsorteringar utförs av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Den första är baserad på egenskapen av CSCs att överuttrycka ATP-bindande kassett (ABC) transportproteiner och därmed utesluta, bland andra, viktiga DNA-färgämnen såsom Hoechst 33342. Cellerna sorteras med thär metoden identifieras som en "sido population" (SP). Eftersom SP celler representerar en låg andel (<5%) av modercellerna, är det nödvändigt med en växande fas i syfte att öka deras antal före den andra cellsortering. Nästa steg möjliggör selektion av celler som besitter två andra egenskaper HNSCC stamcells dvs höga expressionsnivån av den cellytmarkör CD44 (CD44 hög) och den överuttryck av aldehyddehydrogenas (ALDH hög). Eftersom användningen av en enda markör har många begränsningar och fallgropar för isolering av CSCs, kombinationen av SP, kommer CD44 och ALDH markörer ge ett användbart verktyg för att isolera CSCs för ytterligare analytiska och funktionella analyser som kräver livskraftiga celler. Stjälkliknande egenskaper CSCs slutligen validerat in vitro genom bildandet av tumorispheres och uttrycket av β-catenin.
Huvud och hals skivepitelcancer (HNSCC) är en vanlig malignitet hela världen och trots framsteg i dagens behandlingar, patienter med avancerad sjukdom har en dålig prognos. Den totala 5 års överlevnad för patienten är cirka 30% trots kombination av terapeutiska metoder, bland annat kirurgi, kemoradioterapi och riktade-behandlingar. Nyligen genomförda studier attribut lokalt återfall och fjärrmetastaser för överlevnaden av cancer stamceller-liknande celler (CSCs) efter cancerbehandling 1. Det finns ackumulerande bevis för förekomsten av celler som presenterar stamceller egenskaper (odifferentierad statussjälvförnyelse och differentiering kapacitet, och telomerasaktivitet) i olika solida tumörer inklusive bröst, hjärna, prostata, lunga, kolon, bukspottkörtel, lever och hud 2- 10. Dock kvarstår ursprung CSCs oklar 11,12. De kan bero på malign transformation av normala stamceller 3,13 eller dedifferenfinfördelning på djupet av tumörceller som förvärvar CSCs liknande funktioner 14,15. Därför kommer förstå distinkta vägar i samband med CSCs ge insikt i tidig diagnos och behandling av resistent HNSCC.
Det har föreslagits att CSCs besitter också resistenta fenotyper som undviker standard kemoterapi och radioterapi, vilket resulterar i tumör återfall jämfört med huvuddelen av tumörcellerna 16-19 och är lokaliserade i hypoxisk nischer 20. Ett stort antal faktorer har föreslagits för att förklara dessa resistanser CSCs, såsom benägenhet till inaktivitet, förbättrad DNA-reparation, uppreglerat cellcykel kontrollmekanismer och fria radikaler 21. Dessutom kan flera onkogena molekylära vägar specifikt aktiveras i CSCs 17. För att förbättra kunskapen om CSCs för ytterligare riktade-behandlingar, vi behöver tillförlitliga metoder för identifiering och isolering av CSCs, på grund av heterogenitet stamcellsrelaterade markörer iolika typer av cancer 22.
I HNSCC, stam-liknande tumör initierande celler har isolerats från primär patientens tumörer genom att sortera celler som uttrycker olika CSC biomarkörer (t.ex. läkemedelsflödes transportörer uttryck 23, CD44 hög, CD24 låg CD133 hög, c-Met -fenotyp 10,24, 25, eller ALDH hög aktivitet 26) eller odla primära patienten tumör att bilda squamospheres som har CSC egenskaper. Ändå har antalet squamospheres minskar dramatiskt efter två passager, vilket ger en liten provstorlek för ytterligare karakterisering studerar 27. Därför in vitro-analyser med utgångspunkt från väletablerade cellinjer är en enklare lösning att utforma experiment för att förbättra kunskapen om CSCs.
Syftet med denna artikel är att föreslå en metod för att isolera CSCs från HNSCC cellinjer med hjälp av multiparameter flödescytometrisk analys ennd cellsortering. Uttrycket av CD44 i samband med flera CSCs egenskaper inklusive ALDH aktivitet, Side Befolkning (SP) fenotyp, sfäroid formation förmåga och tumörbildning användas för att isolera och karaktärisera denna undergrupp av CSCs. CD44, en cellytan glykoprotein, är involverad i celladhesion och migration. CD44 uttrycks starkt i många solida tumörer CSCs 28, bland annat i huvud- och halscancermodeller 29-31. Dessutom kan CD44 höga celler genererar in vivo en heterogen tumör medan CD44 låg celler kan inte 10. SP analysen är baserad på den differentiella potentialen av celler till utflödes Hoechst färgämne 22 via den ATP-bindande kassett (ABC) familjen av transportproteiner överuttrycks inom CSC membranet. Denna analys innefattar användningen av ABC-transporthämmare såsom verapamil i kontrollprover. Aldehyddehydrogenas (ALDH) är en intracellulär enzym som är involverat i att omvandla retinol att retinoic syra under tidig stamcellsdifferentiering 25,26. Celler som uppvisar hög ALDH-aktivitet show stem-liknande cellbeteende i HNSCC 26 och ett mycket få antal ALDH höga celler kan generera tumörer in vivo 26,32.
Kombinationen av dessa markörer och egenskaper har med framgång använts av Bertrand e t al. För att studera resistens in vitro och in vivo av dessa CSCs foton och kol joniserad strålning 19. Deras resultat visade tydligt att kombinationen av olika cellmarkörer och egenskaper är mer selektiva för användbara studier på HNSCC CSCS populationer än en enda markör metoder.
Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för att framgångsrikt isolera CSCs från en specifik cellinje som är tillämpbar på andra HNSCC cellinjer. Isolerade huvud- och hals CSCs lämpar sig sedan för ytterligare molekylär karakterisering in vitro och funktionell validering av transplantation i immundefekta möss 19. Dock kan vissa modifieringar testas beroende på den sida populationen eller de CD44 hög / ALDH höga procentandelar som är närvarande i den paren…
The authors have nothing to disclose.
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
DMEM | Gibco | 61965-026 | |
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |