Abstract
두경부 편평 상피 세포 암 (HNSCC) 진행에 대한 이해의 진보에도 불구하고, 5 년 생존율 인해 국소 재발 및 원격 전이 낮은 유지된다. 이러한 재발을 설명하기위한 하나의 가설은 고유의 화학 치료 및 전파 저항을 제시 암 줄기 유사 세포 (CSC 추가)의 존재이다. 새로운 치료 전략을 개발하기 위하여, 표적 치료의 효과를 검증 실험 모델을 가지고 있으므로 된 CSC의 동정 및 분리를위한 신뢰성있는 방법이 필요하다. 이를 위해 정렬 형광 활성화 된 세포에 의해 수행되는 연속 된 두 셀 sortings (FACS)의 조합에 의존 HNSCC 인간 세포주에서 CSC 추가의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 첫 번째는 다른 사람의 사이에서 제외 따라서 카세트 (ABC) 트랜스 포터 단백질을 ATP가-바인딩 및 과발현하는 암줄 기세포의 특성을 기반으로, 같은 헥스 33342. 세포 같은 중요한 DNA 염료 번째로 정렬방법은 "측면 인구"(SP)로 식별됩니다. SP에 세포가 낮은 비율 부모 세포 (<5 %)을 나타내는 바와 같이, 성장 단계는 제 2 셀 정렬 전에 수를 증가시키기 위해 필요하다. 다음 단계는 두 HNSCC 줄기 세포 특성은 세포 표면 마커 CD44 (고 CD44) 및 알데히드 탈수소 효소의 과발현 (ALDH 높음)의 높은 발현 수준을, 즉 보유 세포의 선택을 허용한다. 단일 마커의 사용 된 CSC, SP의 조합의 분리 수많은 제한 및 함정을 갖기 때문에, CD44 및 ALDH 마커는 생존 세포를 필요로 상기 분석 및 기능 분석을위한 된 CSC를 분리하는 유용한 도구를 제공 할 것이다. 암줄 기세포의 줄기 같은 특성은 마지막으로 tumorispheres의 형성과 β-catenin의 발현에 의해 시험 관내에서 확인되었다.
Introduction
머리와 목 편평 세포 암 (HNSCC)는 전 세계 공통의 악성 종양이며, 현재 치료의 발전에도 불구하고, 고급 질환 환자는 예후가있다. 환자의 전체 5 년 생존율은 수술, 화학 - 방사선 요법 - 및 대상을 포함한 치료 적 접근법의 조합에도 불구하고 약 30 %이다. 최근의 연구는 항암 치료 한 다음 암 줄기 같은 세포의 생존 (암줄 기세포)에 국소 재발과 원격 전이 때문이다. 유방, 뇌, 전립선, 폐, 결장, 췌장, 간, 피부 2- 등 다양한 고형 종양 줄기 세포 특성 (미분화 상태,자가 재생과 분화 능력 및 텔로 머라 제 활성)을 제시 세포의 존재를지지 축적 증거가있다 10. 그러나, 암줄 기세포의 기원은 11, 12 불분명 남아 있습니다. 그들은 정상적인 줄기 세포 3,13 또는 dedifferen의 악성 변환으로 인해 발생할 수있는암줄 기세포와 같은 기능 14, 15를 취득 종양 세포의 tiation. 따라서 암줄 기세포에 관한 독특한 경로를 이해하는 것은 조기 진단과 저항 HNSCC의 치료에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다.
된 CSC는 종양 세포 16-19의 부피에 비해 종양의 재발을 초래 표준 화학 요법과 방사선 치료를 회피 내성 표현형을 갖고, 20 틈새 저산소에 지역화 된 것이 제안되어왔다. 다양한 요소 그러한 정지 성향 등 CSC 추가의 저항이, 강화 된 DNA 수리, 상향 조절 세포주기 제어 메커니즘 및 자유 라디칼 소거능 (21)을 설명하기 위해 제안되었다. 또한, 여러 가지 종양의 분자 경로 구체적 된 CSC (17)에서 활성화 될 수있다. 또한 대상-치료를위한 암줄 기세포의 지식을 개선하기 위해, 우리는 줄기 세포 관련 마커의 이질성에 때문에, 식별 및 암줄 기세포의 분리를위한 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다암 (22)의 다양한 종류.
HNSCC에서, 줄기 등을 종양 시작 세포와 같은 약물 유출 컨베이어 식 (23), CD44 높은, CD24 낮은 CD133 고, C-메트로 + 10, 24을 표현형으로 다른 CSC의 바이오 마커를 (발현하는 세포를 정렬하여 주 환자의 종양에서 고립 된, 25, 또는 ALDH 활성이 높은 26) 또는 CSC 속성이 squamospheres을 형성하는 주요 환자의 종양 양성. 그럼에도 squamospheres의 개수는 따라서 더 특성화 작은 샘플 크기 (27)을 연구주는 두 통로 후 급격히 감소한다. 따라서, 생체 외 분석이 잘 확립 된 세포주로부터 시작하는 CSC 추가의 기술을 개선하기 위해 실험을 설계하기 쉬운 해결책이다.
이 문서의 목적은 multiparametric 유세포 분석 A를 사용 HNSCC 세포주에서 암줄 기세포를 분리하는 방법을 제안하는 것이다차 셀 정렬. ALDH 활동 등 여러 암줄 기세포의 특성과의 상관 관계에서 CD44의 발현은, 사이드 인구 (SP) 표현형, 회전 타원체 형성 능력과 발암는 분리와 암줄 기세포의이 하위 집단의 특성을하는 데 사용됩니다. CD44, 세포 표면 당 단백질은 세포 부착 및 이동에 관여한다. CD44은 매우 머리와 목 암 모델 29-31에 포함 암줄 기세포 (28) 많은 고형 종양으로 표현된다. 또한, CD44 높은 세포는 10 수없는 생체 내에서 CD44 낮은 세포 반면, 이종 종양을 생성 할 수 있습니다. SP는 분석은 CSC 내에 과발현 막 수송 단백질의 ATP 결합 카세트 (ABC)를 통해 가정 훽스트 염료 22를 유출하는 세포의 미분 가능성에 기초한다. 이 분석은 대조 시료에서 베라파밀로 ABC 트랜스 포터 억제제의 사용을 포함한다. 알데히드 탈수소 효소 (ALDH)는 마지막 ret 레티놀 변환에 관여하는 세포 내 효소초기 줄기 세포 분화 25, 26시 inoic 산. 높은 ALDH 활동 쇼 HNSCC (26)의 줄기와 같은 세포의 행동과 ALDH 높은 세포의 매우 적은 수를 나타내는 세포는 생체 내 26,32에 종양을 생성 할 수 있습니다.
이러한 마커 및 속성의 조합이 성공적으로 베르트랑 전자 t의 알에 의해 사용되었다. 시험관 내에서 광자하려면 다음 암줄 기세포의 생체 내 탄소 이온 방사선 (19)의 저항을 연구. 그들의 결과는 명확하게 다양한 세포 마커 및 속성의 조합이 단일 마커 방법보다 HNSCC 암줄 기세포 집단에 대한 유용한 연구를위한 더 선택적인 것으로 나타났다.
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Protocol
모든 동물 절차는 동물 보호의 로컬 가이드 라인에 따라 수행 하였다. 이 연구의 모든 세부 사항은 CECCAPP, 프랑스 윤리위원회에 의해 승인되었다.
훽스트 (Hoechst) 염료 유출 분석에 의한 측면 인구 (SP) 1. 선택
- 훽스트 33342 염료로 5 천만 세포를 염색.
- 한 "훽스트 (Hoechst)"라는 레이블이 붙은 튜브와 "훽스트 및 베라파밀"로 표시 한 두 개의 15 ml의에게 원뿔 바닥 멸균 튜브를 준비합니다. 멸균 5mm의 베라파밀 히드로 클로라이드 용액 10 ㎖를 준비한다. 줄기 세포 배양 배지 (CM)을 준비한다.
- 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) : F12 (1 : 3, V : V) 하이드로 코르티손의 소 태아 혈청, 5 % (FCS), 0.04 ㎎ / ℓ CSC (CM-CSC)에 대한 CM을 제조하기 위해, 다음과 결합 페니실린 100 U / ㎖, 0.1 g / L의 스트렙토 마이신, 및 표피 성장 인자 (EGFR) 20 μg의 / L.
- 층류 후드에서 세포를 Trypsinize. 의 세척, 용지를 제거terile 인산 완충 식염수 (PBS)와 75 cm² 플라스크에 대한 트립신 EDTA 1 ㎖ (0.5 g / L)를 추가합니다. 37 ° C에서 3 분을 품어. 부모 세포주 사용 배양액을 첨가하여 반응을 정지. 세포 계수기를 사용하여 세포의 수를 계산.
- 부모 세포주 (CM-P)에 대한 CM을 준비하려면 10 % FCS, 0.4 밀리그램 / 하이드로 코르티손의 L, 페니실린 100 U / ㎖ 및 0.1 g / 스트렙토 마이신의 L)와 DMEM을 보충합니다.
- CM-P 10 7 세포 / ml를 수득하는 단계 1.1.2에서 수득 된 세포 현탁액을 희석. 제조 된 2 튜브에 세포 현탁액을 분할 : 튜브 "훽스트 및 베라파밀"튜브 "훽스트"4 ㎖ (4 × 10 7 세포)에 100 μL (10 6 세포)를 넣습니다.
- 샘플 "훽스트 및 베라파밀"에서, 5 mM의 베라파밀 염산염 용액 (최종 농도 0.5 mM)을 10 μL를 추가하고 부드럽게 혼합한다. (0.1 g / L의 최종 농도) 1g / L 훽스트 용액 5 μl를 추가합니다. 샘플 & #에서(34) 훽스트는 "1g의 5 μl를 추가 / L 훽스트 10 6 세포 당 용액 (200 μL 총) 이제부터, 알루미늄 호일을 사용하여 직사광선 노출로부터 보호 샘플을 유지..
- 1 시간 30 분 동안 37 ℃ 수욕에있는 모든 튜브 부화. 정착에서 세포를 방지하기 위해 부드럽게 매 15 분을 섞는다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 원심 분리기 튜브. 상층 액을 제거하고 1X PBS의 2 mL로 각각의 펠렛을 재현 탁.
- 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 원심 분리기 튜브. 상층 액을 제거합니다. PBS에 희석 재현 탁 "훽스트 및 베라파밀"5 ㎎ / ℓ 요오드화 프로피 듐 (PI) 500 μL의 펠릿을 완충액 5 밀리그램 / PBS 완충액에 희석 된 L PI 4 ㎖ 중의 "훽스트"펠릿.
- 흐름 cytometer에 샘플 이해를 위해 튜브에서 하나의 셀 집계를 제거하고 수집하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 샘플 솔루션을 전송합니다. 얼음에 샘플을 유지하고 알루미늄 호일을 사용하여 직사광선 노출로부터 보호 할 수 있습니다.
- 한 "훽스트 (Hoechst)"라는 레이블이 붙은 튜브와 "훽스트 및 베라파밀"로 표시 한 두 개의 15 ml의에게 원뿔 바닥 멸균 튜브를 준비합니다. 멸균 5mm의 베라파밀 히드로 클로라이드 용액 10 ㎖를 준비한다. 줄기 세포 배양 배지 (CM)을 준비한다.
- 나는셀 정렬에 의해 훽스트 (Hoechst) 염료를 제외 사이드 인구의 solation.
- 상기 다음 매개 변수를 정렬 유동 세포 계측법에 훽스트 부정적인 세포 분리를 수행 UV 레이저 (355 nm의), 블루 훽스트 (BP를 450/50)과 빨간색 훽스트 필터 (BP를 610/20)와 UV 레이저 경로 2 감지기, 2 집.
- 첫째, 염색 및 사이토 설정 흐름에 대한 긍정적 인 제어 역할을 샘플 "훽스트 (Hoechst)"를 분석한다.
- "도트 플롯"를 클릭, "글로벌 워크 시트"창에서 사이토 소프트웨어를 사용하여 (다섯 번째 오른쪽 그림 상단)와 글로벌 워크 시트의 차트를 만들 수 있습니다. 좌표에서 오른쪽 클릭으로, FSC-A (앞으로 분산)과 가로축에, SSC-A (측면 분산 형) (그림 1A)를 선택합니다. 같은 방식으로, SCC-H 도트 플롯 대 SSC-W를 만듭니다. 이 두 번째 도트 플롯에, P1 영역을 만들려면 "다각형 게이트"(열네번째 오른쪽 그림 상단) (그림 1B) (33)을 클릭합니다.
참고 : P1 영역이됩니다하나의 세포를 포함하고 이중선을 구별. - 옵션 : P1에 문 PI 대 FSC-A를 작성하여 PI를 양성 세포를 제외합니다. 이 점 플롯에서 PI 긍정적 인 죽은 세포를 제외 할 PI 부정적인 인구 (P2)을 선택합니다.
- "글로벌 워크 시트"창에서 사이토 소프트웨어를 사용하여, "도트 플롯"을 클릭하고 글로벌 워크 시트의 차트를 만들 수 있습니다. 좌표에서 오른쪽 클릭으로, 블루 훽스트-A를 선택하고 가로축에, 빨간색 훽스트-A. 인구에 오른쪽 클릭으로 "연락처보기 인구"및 P1을 선택합니다. 이 점 플롯에서 영역 (P2) 세포의 주요 인구 (그림 1C)의 왼쪽에있는 사이드 암으로 나타나는 음의 Hoechst 염색 측면 인구 (SP) 셀을 선택하기를 만듭니다.
- 샘플 "훽스트 (Hoechst)"를 분석하고 10,000 이벤트를 수집합니다. SP에 인구를 나타내는 게이트 P2가 잘 배치되었는지 확인하기 위해 샘플을 분석 "훽스트 및 베라파밀"(10,000 건)SP 인구 (그림 1D)의 실종을 관찰합니다.
- 1.1.1.1 제조 CM-CSC 1 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브 내의 SP 훽스트 염료 음성 세포를 수집한다.
- 셀의 정렬이 끝나면, 원심 분리기에서 5 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을, 상등액을 제거하고 CM-CSC 1 mL로 펠렛을 재현 탁. 세포 계수기를 사용하여 정렬 된 셀의 수를 계산하고, 배양 플라스크에 세포의 적절한 수를 전송할 수있다 (표 1 참조). CM-CSC를 추가하고 37 ° C, 5 % CO 2 분위기에서 품어.
- 5 × 107 세포 (단계 3, "세포 배양 방법"참조)의 최소가 될 때까지이 통로의 최대 동일한 조건으로 배양 세포를 유지한다.
- 상기 다음 매개 변수를 정렬 유동 세포 계측법에 훽스트 부정적인 세포 분리를 수행 UV 레이저 (355 nm의), 블루 훽스트 (BP를 450/50)과 빨간색 훽스트 필터 (BP를 610/20)와 UV 레이저 경로 2 감지기, 2 집.
측면 인구 조회 결과 순위에서 CD44 높은 / ALDH가 높은 하위 인구의 2 선택
- ALDH 검출 키트 및 C와 SP 세포의 50 만 달러를 염색D44 항체.
- "흠"(튜브 A) "CD44-APC"(튜브 나) "의 IgG1-APC"(튜브 C), "ALDH"(튜브 라) "ALDH 및 DEAB을 다음과 같이 일곱 15 ml의를 표시 멸균 튜브를 준비합니다 "(튜브 전자),"ALDH 및 CD44-APC "(튜브 F),"ALDH, DEAB 및 CD44-APC "(튜브 g). 염색 동안 4 ° C에서 모든 튜브와 시약을 보관하십시오.
- 4.5 (키트에 포함) 버퍼 1 mL 및 CD44-APC (알로 피코) 항체 (: 100 희석 1) 45 μL와 버퍼 A를 준비합니다. 버퍼 (1) 100 ㎕와의 IgG1-APC 항체의 1 μL (: 100 희석 1)와 버퍼 B를 준비합니다. 버퍼 (1)의 4 ml의 키트의 시약에 20 ㎕의 완충액 C를 준비한다.
- 107 세포 / ml의 이전 정렬 세포 (단계 1.2.5)의 세포 현탁액을 준비한다. A, B 및 C, 및 튜브 F 4 ㎖ (4 × 107 세포)를 튜브 세포 현탁액 100 μL (10 106 세포)를 추가한다. 순간 튜브 D, E와 g에서 세포를 넣지 마십시오.
- 5 분 동안 250 XG에 세포를 포함하는 튜브를 원심 분리기. diethylaminobenzaldehyde의 5 μL (DEAB), 튜브 전자와 g에 ALDH 억제제를 추가 상층 액을 제거하고 튜브 A, B 및 버퍼 (1) 100 ㎕에 C에서 펠렛을 재현 탁.
- 4 ml의 시약 C와 즉시 F 튜브를 Resuspend 세포는 튜브 D, E와 g에 100 μl를 전송합니다. 30 분 동안 37 ℃ 수욕에있는 모든 튜브 부화 알루미늄 박을 사용하여 직접 노광으로부터 보호한다. 침강 세포를 방지하기 위해 15 분 후 가볍게 볼 텍싱하여 세포 현탁액을 혼합한다.
- 이 순간부터, 얼음에 튜브를 유지하고 알루미늄 호일을 사용하여 직사광선 노출로부터 보호. 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 250 XG에 튜브가 뜨는을 제거합니다.
- 4 mL 및 다른 관으로 버퍼 B. 100 ㎕와 버퍼 A. 재현 탁 관 C 100 ㎕와 b를 g 튜브에 재현 탁 튜브 F 1. 품어 10 분 4 °에서 버퍼의 100 μl를 추가;기음.
- 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 250 XG에 튜브가 뜨는을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 다시 1 버퍼 1 ㎖ (튜브 F 4 ㎖) 및 원심 분리기로 한번 씻어. 뜨는을 제거합니다. 다시 일시 중지 4 mL 및 버퍼 (1) 1 ㎖에있는 다른 모든 튜브 튜브 F 펠렛을.
- 사이토 흐름에 샘플 이해에 대한 적절한 튜브 단일 세포 집계를 제거하고 수집하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 샘플 솔루션을 전송합니다.
- 형광에 의한 CD44 고 / ALDH 높은 세포 인구의 격리 셀 정렬을 활성화.
- 수행 CD44 높은 / ALDH 상기 다음 매개 변수를 정렬 유동 세포 계측법에 정렬 높은 세포하십시오 FITC 필터 (30분의 530), 1과 블루 레이저 경로에 블루 레이저 (488 nm의)과 적색 레이저 (633 nm의), 1 검출기 APC에서 필터 (20분의 660), 2 집과 적색 레이저 경로 검출기.
- 사이토 소프트웨어를 사용하여 점 플로 "를 클릭t "(다섯 번째 오른쪽 사진) 섹션 1.2.1.2에 기술 된 바와 같이, SSC-A 도트 플롯 대 FSC-A를 생성하는 세포 형태를 확인하고 SSC-H 대 SSC-W와 함께 단일 세포로 구성 인구를 선택 도트 플롯.
- "글로벌 워크 시트"창에서 사이토 소프트웨어를 사용하여, "도트 플롯"을 클릭하고 글로벌 워크 시트의 차트를 만들 수 있습니다. 좌표에서 오른쪽 클릭으로, 이중 스테인드 인구를 선택하기 위해 APC-A 및 가로 좌표, FITC-A에를 선택합니다. ALDH 높은 세포 (그림 2A)을 선택 D와 E 튜브를 사용하여 게이트를 만듭니다. 참고 : 긍정적 인 세포 DEAB (그림 2B)로 처리 튜브 전자에서 사라집니다.
- 같은 차트에서 CD44 높은 세포 (그림 2C 및 2D)를 선택하기 위해 튜브 b와 c를 사용하여 제 2 게이트를 만들 수 있습니다. 양성 세포의 IgG1-APC를 포함하는 튜브에 사라진다. F와 G 튜브를 분석하고 CD44 높은 / ALDH을 <포함하는 제 3 게이트를 만들SUP> 높은 세포 (그림 2E 및 2 층).
주 : 양성 세포의 IgG1-APC (도 2d)를 포함하는 튜브에 존재하는 경우, 세포와 APC 염색 항체 사이의 상호 작용은 특정하지 않다.
- 같은 차트에서 CD44 높은 세포 (그림 2C 및 2D)를 선택하기 위해 튜브 b와 c를 사용하여 제 2 게이트를 만들 수 있습니다. 양성 세포의 IgG1-APC를 포함하는 튜브에 사라진다. F와 G 튜브를 분석하고 CD44 높은 / ALDH을 <포함하는 제 3 게이트를 만들SUP> 높은 세포 (그림 2E 및 2 층).
- CM-CSC 1 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 높은 CD44 / ALDH에게 높은 세포를 수집한다. CM (19) 1 ㎖를 포함하는 15 ML 튜브에 저 또한 CD44 저 / ALDH를 수집합니다. 참고 : 단계 1.1.1.1에 기술 된 바와 같이 CM-CSC를 준비합니다.
- 5 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을 원심 분리하여 상층 액을 제거하고, CM-CSC 1 mL로 펠렛을 재현 탁. 정렬 된 셀의 수를 계산.
3. 세포 배양 방법
- 전술 한 바와 같이 셀의 두 분류 후에, 5 % CO 2, 37 ℃에서 CM-CSC와 적절한 배양 플라스크 (표 1)에 정렬 된 셀 플레이트. 18 ~ 24 시간 후,세포가 부착 된 경우 확인하고 배지를 변경합니다. 확대 식민지는 50 %의 합류보다 큰까지 3 일마다 배지를 변경합니다.
- 문화 플라스크에서 세포를 Trypsinize하는 EDTA (표 1) - 트립신 0.5 g / L의 적절한 볼륨을 사용합니다. 37 ° C에서 세포에게 3-5 분을 품어. 트립신의 작용을 중지 CM-CSC (표 1)의 적절한 볼륨을 추가합니다.
- 얻어진 세포와 판 CM-CSC와 175 cm² 문화 플라스크에 4 × 10 5 세포의 수를 계산합니다. 37 ° C에서 품어 5 % CO 2. 이 농도에서 24 시간의 배가 시간이 세포는 7 일 70 % 합류 할 것이다.
- 그들은 3 구절을 시행하기 전에 시험 관내 또는 생체 내 실험에서 암줄 기세포를 사용합니다.
종양의 가능성과 CSC 특성 4. 확인
- 종양 구 형성은 CD44 높은 / ALDH의 종양 가능성을 확인하기 위해높은 세포.
- 3.2에 기재된 바와 같이 세포를 Trypsinize. 5 분 동안 250 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 1 × 10 6 세포를 추가합니다. 뜨는을 제거하고 DMEM에서 펠렛 다시 일시 : F12 (3 : 1) rhEGF 처치의 매체 FCS 무료, 20 ng를 / ㎖, 헤파린 및 1 배 B27의 4 ㎎ / ℓ를. 37 ° C에서 6도 낮은 고정 플레이트 문화 플라스크에 세포를 품어 5 % CO 2.
주 : 사용을 DMEM : F12 (3 : 1) FCS의 5 %, 20 ng를 rhEGF 미 / ㎖, 4 밀리그램 / L 헤파린 및 1X B27 셀은 FCS없이 증가하지 않는 경우를 포함하는 매체. - (도 3a)를 파종 한 후 4 내지 10 일에서 광학 현미경으로 종양 형성 영역을 관찰한다.
참고 : 종양 구 직경이 35 개 이상의 μm의 수 있어야합니다. CD44 고 / ALDH 높은 세포는 CD44 저 / ALDH의 낮은에 비해 수와 크기면에서 더 빠르고 향상된 종양 구 형성을 표시합니다.
- 3.2에 기재된 바와 같이 세포를 Trypsinize. 5 분 동안 250 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 1 × 10 6 세포를 추가합니다. 뜨는을 제거하고 DMEM에서 펠렛 다시 일시 : F12 (3 : 1) rhEGF 처치의 매체 FCS 무료, 20 ng를 / ㎖, 헤파린 및 1 배 B27의 4 ㎎ / ℓ를. 37 ° C에서 6도 낮은 고정 플레이트 문화 플라스크에 세포를 품어 5 % CO 2.
- 생체 내 종양 유발의 평가 후NOD-SCID 마우스에서 CD44 높은 / ALDH 높은 세포의 피하 주사.
- 정렬 후, 세 가지 농도 (104 세포 / ㎖, 105 세포 / ㎖, 10 6 세포 / ml)에서 PBS로 세포를 재 - 보류. 6 마우스의 우측 옆구리에 피하 영역 10 4 세포 / ㎖ (× 103 세포) 100 ㎕를 주입한다. 105 세포 / ㎖ (104 세포) 및 106 개 세포 / ㎖ (105 세포)를 위해 동일한 작업을 수행.
참고 : 10 3 세포를 테스트 할 수있는 것보다 낮은 희석. - 왼쪽 측면 지역에서 CD44 저 / ALDH 낮은 세포의 동일한 농도를 주입한다. 최대 10 주 동안 모니터 주입 된 마우스는 종양 진행 (19)을 볼 수 있습니다.
- 정렬 후, 세 가지 농도 (104 세포 / ㎖, 105 세포 / ㎖, 10 6 세포 / ml)에서 PBS로 세포를 재 - 보류. 6 마우스의 우측 옆구리에 피하 영역 10 4 세포 / ㎖ (× 103 세포) 100 ㎕를 주입한다. 105 세포 / ㎖ (104 세포) 및 106 개 세포 / ㎖ (105 세포)를 위해 동일한 작업을 수행.
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Representative Results
HNSCC 셀 라인에서 암줄 기세포의 분리 때문에 부모 세포주에서 암줄 기세포의 매우 낮은 비율의 두 개의 연속 정렬이 필요합니다. 첫 번째 분류는 약물 유출 수송에 의한 훽스트 (Hoechst) 염료를 제외 할 암줄 기세포의 능력에 근거했다. 이 분류 전체 세포 인구 (그림 1) 1-5 %를 인수 결과. 의 Hoechst 염색 부정적인 셀 정렬하는 동안, SSC-A 도트 플롯 (그림 1A) 대 FSC-A를보고 크기와 정렬 세포의 과립을 확인합니다. 그리고, 인구 P1 (도 1b)를 SSC-H 도트 플롯 대 SSC-W를 사용하여 선택하여 이중선 및 세포 파편을 식별. 이 P1 인구에서 훽스트 블루 도트 플롯 대 헥스 레드-A를 만듭니다. "훽스트 (Hoechst)"라는 레이블이 붙은 튜브로, SP는 주요 세포 인구 (그림 1C)에서 왼쪽 사이드 암으로 나타납니다. 그들은 아칸소 경우 인구가 사라합니다베라파밀 (그림 1D), ABC 트랜스 포터의 억제제로 치료 전자. 이 인구에서-스케일 헥스 레드-A 규모 (그림 1C 및 1D, 파란색 타원)에 있기 때문에 PI 염색은 PI 양성 죽은 세포의 배제를 할 수 있습니다.
두 번째 셀 정렬 이전에 (도 2) 정렬 SP 세포 0.5-2 %의 취득을 허용 CD44 수용체와 높은 ALDH 효소 활성의 고 발현에 기초 하였다. 정렬 전에 다양한 제어 사용 하였다. 첫 번째 사람은 "ALDH"와 FITC 높은 세포 (도 2A와 2B)에 제 1 게이트를 배치하기 위해 필요한 "ALDH + DEAB"튜브 있습니다 ALDH 높은 세포는 APC-A 점 대 FITC-A에 문이 있었다 은 "ALDH"튜브 (도 2A)을 사용하여 플롯. 게이트의 좋은 위치는 "ALD를 이용하여 조사 하였다H + DEAB "는 튜브 :.. DEAB는 ALDH 억제 같이 양성 세포 게이트 (도 2B)에서 사라해야들은 (예 DEAB의 양을 증가시킴으로써) 반응 조건을 변경하지 않는 경우에는 제 2 제어이며" CD44-APC "및"는 CD44-APC 항체 (그림 2C)로 염색 세포를 사용하여 APC 높은 세포 (도 2C 및 2D)에 제 2 게이트를 배치 할 수의 IgG1-APC "관.이 인구가 사라합니다 이 수행되지 않은 경우의 IgG1-APC 세포 (도 2D)에 포함 된 제어 튜브. 항체와 결합이 0.5 %가 항체 반응 동안 ALDH 검출 키트 버퍼 (1)에 추가되어야 특정되지 않고 BSA. 마지막 세 번째 컨트롤이 "ALDH 및 CD44-APC"튜브 "ALDH, DEAB 및 CD44-APC"튜브 (도 2E, 2F, 2G 및 하반기)에 관한 것이다. 이중 역ining ALDH / CD44 튜브는 이중 양성 세포 (그림 2E)과 DEAB 처리 같은 튜브의 마지막 게이트를 배치하는 데 사용됩니다 ALDH 높은 세포 (그림 2 층)을 사라 있는지 확인하는 컨트롤입니다.
이 프로토콜은 SQ20B과 FaDu 세포주에서 암줄 기세포를 정렬하는 데 사용됩니다. 정렬이 정렬 줄기 세포와 같은 세포의 특성을 갖는 것을 보장하기 위해, 새로운 세포주에서 처음으로 수행되는 경우, 그들의 종양 가능성을 확인하는 것이 필요하다. 줄기 같은 세포의 특성 중 하나는 FSC 무료 매체에 체외에서 tumorspheres을 형성하는 기능입니다. 이 상태에서, 단지 암 줄기 같은 세포가 생존 할 수 있으며 (그림 3A)를 증식. 또한 qPCR의 실험은 CD44 고 / ALDH 높은 세포 (도 3B)에서 β 카테닌 (줄기와 같은 특성의 마커)의 높은 발현을 보여줄뿐 아니라 BMI-1 노치 (19) </ SUP>. 마지막으로, CD44 고 / ALDH 높은 세포는 CD44 저 / ALDH 낮은 셀 (19)에 비해 낮은 양으로 주입하면 종양을 형성 할 수있다.
그림 1 : 훽스트 (Hoechst) 염료를 제외한 측면 인구의 분리 SSC-A 도트 플롯 대 (A) FSC-A.. (B) SSC-H 도트 플롯 대 SSC-W. (C, D) 훽스트 레드-A 훽스트 블루-A은 "훽스트"튜브 (C) 또는 "훽스트 및 베라파밀"관 (D)과를 사용하여 도트 플롯. 대 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 그래서 훽스트 염료 음성 세포에서 CD44 고 / ALDH 높은 세포 rting.은 "ALDH"튜브 (A)는 "ALDH + DEAB"튜브 (B)는 "CD44-APC"를 사용 APC-A 도트 플롯 대 FITC-A 튜브 (C)은 "의 IgG1-APC"관 (D)은 "ALDH 및 CD44-APC"튜브 (E 및 G) 또는 "ALDH, DEAB 및 CD44-APC"튜브 (F 및 H). 도 A는, B, C, D, E 및 F는 SQ20B 세포주를 사용하여 수득 하였다. 도 G와 H는 FaDu 세포주를 사용하여 얻은. 녹색 CD44 저 / ALDH 낮은 세포 (Q3)을 나타내고, 진한 파란색은 CD44 저 / ALDH 높은 세포 (Q1)을 나타내고, 보라색은 CD44 고 / ALDH 낮은 세포 (Q4)을 나타내고, 밝은 파란색은 CD44 고 / ALDH 높은 세포 (Q2)를 나타냅니다._upload / 53958 / 53958fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. CD44 높은 / ALDH 높은 세포의 정렬 된 CD44 고 / ALDH 높은 세포 종양 가능성의 확인은 가난한-FCS 미디어에 tumorspheres 시험관 (A)를 형성 할 수 있었다. 스케일 바, 25 μm의. 또한, CD44 고 / ALDH 높은 과발현의 β-catenin이, 발암 (B)의 마커. 이 정량이 qPCR에 오류 막대로 SD를 나타냅니다 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 세포의 수분류 | 문화 플라스크 형 | 트립신의 양 (㎖) | 문화 매체 볼륨 (ML) |
| 10,000-200,000 | 6 잘 판의 1도 또는 3.5 cm 배양 접시 | 0.5 | 이 |
| 200,000-1,000,000 | 1 T25 문화 플라스크 | 1 | 4 |
| > 1,000,000 | 1 T75 문화 플라스크 | 이 | (10) |
표 1 : 배양 플라스크 유형 분류 세포의 수에 따라 사용하는 배양 플라스크 사이즈 상세 주어진 정렬 셀 대략 번호.. 트립신 배양 플라스크 유형에 필요한 매체 볼륨의 양이 또한 제공된다.
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Discussion
이 프로토콜은 다른 HNSCC 세포주에 적용되는 특정 세포주에서 CSC 추가의 성공적인 분리를위한 신뢰성있는 방법을 설명한다. 격리 된 머리와 목 암줄 기세포는 면역 결핍 마우스 (19)에 이식하여 체외 및 기능 검증에 더 분자 특성화 다음에 적합하다. 그러나 일부 수정 측면 인구 또는 부모 세포주에 존재하는 CD44 고 / ALDH 높은 비율에 따라 테스트 할 수 있습니다. 사이드 인구 세포의 비율이 특정 세포주에서 너무 낮은 경우, 예를 들어, CD44 고 / ALDH 높은 분류를 직접 수행 할 수있다. 본 연구에 사용 된 마커는 CD133 CD10 고 (34) 또는 (35)로 높은 세포주에 적합한 다른 마커에 의해 연구 대체 될 수있다.
이 프로토콜은 두 개의 셀 sortings에 기초한다. SP + CD44 + ALDH으로 정렬 세 가지 색상이 possibl하지 않았다테스트 셀 라인 전자. 우선, 부모 세포주는 SP로 SP의 여기 본 5 % 이하 및 10 % 이하의 높은 CD44 / ALDH 높은 세포를 시험 하였다. 따라서, SP / CD44 고 / ALDH 높은 부모 세포주의 0.5 % 미만을 나타낸다. 따라서, 제 SP 정렬은 CD44에 높은 및 / 또는 ALDH 높은 세포 집단을 풍부하게하기 위해 필요하다. 둘째, 부모 세포주의 1 %를 정렬하기 위해서는, 약 300,000 세포를 얻기 위해 5 시간 걸린다. 3 색 셀 정렬이 수행되는 경우, 따라서, 수집 된 세포의 양이 매우 낮을 것이다. 또한, 이상 정렬은 세포 생존에 영향을 미칠 수 있으므로 사용하지 않는 것이 좋습니다.
이 격리 프로토콜의 선택에 의해, 주요 제약은 획득 된 CSC 소수이다. 이 때문에 CD44와의 급속한 손실의 3 구절 후이를 사용하지 않는 것이 좋습니다 때문에 이것은, 추가 실험을 수행 할 문제가 될 수있다LDH 마커. 또한, 각각의 새로운 실험 전에 세포 현탁액에서 여전히 높은 CD44 / ALDH 높은 세포의 비율은 분화 된 CSC있다 수를 확인하기 위해 테스트되어야한다.
베라파밀 염산염 용액 및 이러한 분자가 매우 불안정으로 사용 직전 EGF를 포함하는 배지를 준비하는 것이 필수적이다. 20 ㎎ / ℓ의 EGF의 스톡 용액을 -20 ° C에서 3 개월 동안 안정하다. 훽스트 프로토콜의 변형이 존재하지만, 일반적으로 사용되는 염료의 최종 농도 5 ㎍ / ml 인 것을. 또한, 제 정렬 동안, 다른 배양 배지 조성물에 사용되는 세포주에 따라 시험한다. 정렬 조건이 확인되면, 이는 다른 방법 (제 4)을 사용하여 정렬 된 세포 집단의 특성을 확인하는 것이 필요하다.
세포 표면 마커 ALDH 활성 및 중요한 염료를 유출 할 수있는 능력을 이미 individua 사용되고에서야 문헌에 HNSCC에서 암줄 기세포를 분리합니다. 그러나, 여기에 설명 된 프로토콜 HNSCC 세포주로부터 분리 된 CSC에 높은 특이성을 달성하기 위해, 각종 마커의 조합을 이용하여 고유의 장점을 갖는다. 또한, CD44은 자석 열 (36)과 자성 마이크로 비드가 결합하고 정렬 항체 항 CD44 실현할 수 정렬하지만,이 방법은 두 정렬을 방지 세포 표면 마커에만 적용하고 ALDH 정렬을 위해 사용될 수 없다 . 된 CSC를 얻기 위해 사용하는 또 다른 방법은 일차 종양 이종 이식 (37) 또는 (38)로부터 tumorsphere 배양한다. 그러나 이러한 기본 종양 또는 이종 이식의 인수는 윤리적 제약과 연결되어 있습니다.
이 방법은 실행 가능한 HNSCC의 암줄 기세포를 분리하기 때문에, 이들 세포의 생리 기능을 측정하는 실험을 다수의 (그 발암 확인 후) 사용될 수있다. 따라서, 동작의 평가를 허용암줄 기세포의 다른 치료 방법 (방사선 치료, 화학 요법)를 다음과 같습니다. 또한 등과 이주 / 침윤, DNA 수리, 세포 신호와 같은 다양한 생물학적 파라미터를 연구 할 수있다. 따라서, 다른 세포주에서 암줄 기세포를 획득하는 암줄 기세포의 특성을 조사하기위한 매력적인 선택이 될 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
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