Abstract
Trots framsteg i förståelsen av huvud och hals skivepitelcancer (HNSCC) progression, förblir den femåriga överlevnaden låg på grund av lokalt återfall och fjärrmetastaser. En hypotes för att förklara detta återfall är närvaron av cancer stamceller liknande celler (CSCS) som presenterar inneboende kemo- och radioresistens. För att utveckla nya behandlingsstrategier, är det nödvändigt att ha experimentella modeller som validerar effektiviteten av riktade behandlingar och därmed ha tillförlitliga metoder för identifiering och isolering av CSCs. För detta ändamål, presenterar vi ett protokoll för isolering av CSCs från HNSCC cellinjer mänskliga som bygger på en kombination av två på varandra följande cellsorteringar utförs av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Den första är baserad på egenskapen av CSCs att överuttrycka ATP-bindande kassett (ABC) transportproteiner och därmed utesluta, bland andra, viktiga DNA-färgämnen såsom Hoechst 33342. Cellerna sorteras med thär metoden identifieras som en "sido population" (SP). Eftersom SP celler representerar en låg andel (<5%) av modercellerna, är det nödvändigt med en växande fas i syfte att öka deras antal före den andra cellsortering. Nästa steg möjliggör selektion av celler som besitter två andra egenskaper HNSCC stamcells dvs höga expressionsnivån av den cellytmarkör CD44 (CD44 hög) och den överuttryck av aldehyddehydrogenas (ALDH hög). Eftersom användningen av en enda markör har många begränsningar och fallgropar för isolering av CSCs, kombinationen av SP, kommer CD44 och ALDH markörer ge ett användbart verktyg för att isolera CSCs för ytterligare analytiska och funktionella analyser som kräver livskraftiga celler. Stjälkliknande egenskaper CSCs slutligen validerat in vitro genom bildandet av tumorispheres och uttrycket av β-catenin.
Introduction
Huvud och hals skivepitelcancer (HNSCC) är en vanlig malignitet hela världen och trots framsteg i dagens behandlingar, patienter med avancerad sjukdom har en dålig prognos. Den totala 5 års överlevnad för patienten är cirka 30% trots kombination av terapeutiska metoder, bland annat kirurgi, kemoradioterapi och riktade-behandlingar. Nyligen genomförda studier attribut lokalt återfall och fjärrmetastaser för överlevnaden av cancer stamceller-liknande celler (CSCs) efter cancerbehandling 1. Det finns ackumulerande bevis för förekomsten av celler som presenterar stamceller egenskaper (odifferentierad statussjälvförnyelse och differentiering kapacitet, och telomerasaktivitet) i olika solida tumörer inklusive bröst, hjärna, prostata, lunga, kolon, bukspottkörtel, lever och hud 2- 10. Dock kvarstår ursprung CSCs oklar 11,12. De kan bero på malign transformation av normala stamceller 3,13 eller dedifferenfinfördelning på djupet av tumörceller som förvärvar CSCs liknande funktioner 14,15. Därför kommer förstå distinkta vägar i samband med CSCs ge insikt i tidig diagnos och behandling av resistent HNSCC.
Det har föreslagits att CSCs besitter också resistenta fenotyper som undviker standard kemoterapi och radioterapi, vilket resulterar i tumör återfall jämfört med huvuddelen av tumörcellerna 16-19 och är lokaliserade i hypoxisk nischer 20. Ett stort antal faktorer har föreslagits för att förklara dessa resistanser CSCs, såsom benägenhet till inaktivitet, förbättrad DNA-reparation, uppreglerat cellcykel kontrollmekanismer och fria radikaler 21. Dessutom kan flera onkogena molekylära vägar specifikt aktiveras i CSCs 17. För att förbättra kunskapen om CSCs för ytterligare riktade-behandlingar, vi behöver tillförlitliga metoder för identifiering och isolering av CSCs, på grund av heterogenitet stamcellsrelaterade markörer iolika typer av cancer 22.
I HNSCC, stam-liknande tumör initierande celler har isolerats från primär patientens tumörer genom att sortera celler som uttrycker olika CSC biomarkörer (t.ex. läkemedelsflödes transportörer uttryck 23, CD44 hög, CD24 låg CD133 hög, c-Met -fenotyp 10,24, 25, eller ALDH hög aktivitet 26) eller odla primära patienten tumör att bilda squamospheres som har CSC egenskaper. Ändå har antalet squamospheres minskar dramatiskt efter två passager, vilket ger en liten provstorlek för ytterligare karakterisering studerar 27. Därför in vitro-analyser med utgångspunkt från väletablerade cellinjer är en enklare lösning att utforma experiment för att förbättra kunskapen om CSCs.
Syftet med denna artikel är att föreslå en metod för att isolera CSCs från HNSCC cellinjer med hjälp av multiparameter flödescytometrisk analys ennd cellsortering. Uttrycket av CD44 i samband med flera CSCs egenskaper inklusive ALDH aktivitet, Side Befolkning (SP) fenotyp, sfäroid formation förmåga och tumörbildning användas för att isolera och karaktärisera denna undergrupp av CSCs. CD44, en cellytan glykoprotein, är involverad i celladhesion och migration. CD44 uttrycks starkt i många solida tumörer CSCs 28, bland annat i huvud- och halscancermodeller 29-31. Dessutom kan CD44 höga celler genererar in vivo en heterogen tumör medan CD44 låg celler kan inte 10. SP analysen är baserad på den differentiella potentialen av celler till utflödes Hoechst färgämne 22 via den ATP-bindande kassett (ABC) familjen av transportproteiner överuttrycks inom CSC membranet. Denna analys innefattar användningen av ABC-transporthämmare såsom verapamil i kontrollprover. Aldehyddehydrogenas (ALDH) är en intracellulär enzym som är involverat i att omvandla retinol att retinoic syra under tidig stamcellsdifferentiering 25,26. Celler som uppvisar hög ALDH-aktivitet show stem-liknande cellbeteende i HNSCC 26 och ett mycket få antal ALDH höga celler kan generera tumörer in vivo 26,32.
Kombinationen av dessa markörer och egenskaper har med framgång använts av Bertrand e t al. För att studera resistens in vitro och in vivo av dessa CSCs foton och kol joniserad strålning 19. Deras resultat visade tydligt att kombinationen av olika cellmarkörer och egenskaper är mer selektiva för användbara studier på HNSCC CSCS populationer än en enda markör metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt lokala riktlinjer för djurvård. Alla detaljer i denna studie har godkänts av CECCAPP, en fransk etisk kommitté.
1. Val av en Side Befolkning (SP) av Hoechst Dye Efflux Assay
- Färgning 50 miljoner celler med Hoechst 33342 färgämne.
- Bered två 15 ml sterila rör med konisk botten: en tub märkt "Hoechst" och en märkt "Hoechst och Verapamil". Förbered 10 ml av 5 mM Verapamil hydroklorid-lösning i sterilt vatten. Förbereda odlingsmediet (CM) för stamceller.
- Att förbereda CM för CSC (CM-CSC), kombinera följande: Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM): F12 (1: 3, volym: volym), 5% fetalt kalvserum (FCS), 0,04 mg / I av hydrokortison , 100 U / ml penicillin, 0,1 g / i av streptomycin, och 20 | j, g / L av epidermal tillväxtfaktor (EGFR).
- Under ett dragskåp med laminärt flöde, trypsinize celler. Ta bort media, tvätta med sterile fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt 1 ml trypsin-EDTA (0,5 g / L) för en 75 cm ^ kolv. Inkubera 3 min vid 37 ° C. Stoppa reaktionen genom att tillsätta odlingsmedium som används för den parentala cellinjen. Räkna antalet celler med användning av en cellräknare.
- Att förbereda CM för modercellinjen (CM-P), komplettera DMEM med 10% FCS, 0,4 mg / I av hydrokortison, 100 U / ml penicillin och 0,1 g / L streptomycin).
- Späd cellsuspensionen som erhållits i steg 1.1.2 för att erhålla 10 7 celler / ml i CM-P. Split cellsuspensionen i 2 rör beredda: sätta 100 ^ (10 6 celler) i röret "Hoechst och Verapamil" och 4 ml (4 x 10 7 celler) i röret "Hoechst".
- I provet "Hoechst och Verapamil", tillsätt 10 | il av 5 mM Verapamil hydrokloridlösning (slutkoncentration: 0,5 mM) och blanda försiktigt. Tillsätt 5 | il av 1 g / L Hoechst-lösning (slutlig koncentration: 0,1 g / L). I provet & #34, Hoechst ", tillsätt 5 pl 1 g / L Hoechst lösning per 10 6 celler (200 pl totalt) Hädanefter hålla prover skyddas från direkt ljusexponering med hjälp av aluminiumfolie..
- Inkubera alla rör i ett vattenbad vid 37 ° C under 1 h 30 min. Blanda försiktigt var 15 min för att förhindra celler från att slå sig ner.
- Centrifugera rören vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera varje pellet med 2 ml 1x PBS.
- Centrifugera rören vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten. Resuspendera "Hoechst och Verapamil" pellet i 500 | il av 5 mg / L propidiumjodid (PI) utspädd i PBS-buffert och "Hoechst" pelleten i 4 ml av 5 mg / L PI utspädd i PBS-buffert.
- Överför provlösningar genom en 70 ìm cell sil för att avlägsna aggregat och samla enstaka celler i rör för provupptagning på flödescytometern. Håll prover på is och skyddas mot direkt ljusexponering med hjälp av aluminiumfolie.
- Bered två 15 ml sterila rör med konisk botten: en tub märkt "Hoechst" och en märkt "Hoechst och Verapamil". Förbered 10 ml av 5 mM Verapamil hydroklorid-lösning i sterilt vatten. Förbereda odlingsmediet (CM) för stamceller.
- jagsolation från Sida Population Exklusive Hoechst färgämne genom cellsortering.
- Utföra Hoechst negativ cell separation på en flödescytometri sorterare med följande parametrar: UV-laser (355 nm), 2 detektorer på UV laserbanan med blå Hoechst (450/50 BP) och röd Hoechst (610/20 BP) filter, och 2 samlare.
- Först analysera prov "Hoechst" som fungerar som en positiv kontroll för färgning och flödescytometer set-up.
- Använda cytometern programvara, på "Global Blad" fönstret, klicka på "Dot Plot" (femte toppen högra bilden) och skapa ett diagram på den globala kalkylbladet. På samordna, med ett högerklick, väljer FSC-A (Forward Scatter) och abskissan SSC-A (sidospridning) (Figur 1A). På samma sätt, skapa en SSC-W kontra SCC-H-plotten. På denna andra punktdiagram, för att skapa en P1 region, klicka på "Polygon gate" (fjortonde top högra bilden) (Figur 1B) 33.
Obs: P1 regionen kommeromfatta enskilda celler och diskriminera dubletter. - Valfritt: Uteslut PI positiva celler genom att skapa en FSC-A kontra PI gated på P1. På denna punktdiagram, välj PI negativ befolknings (P2) för att utesluta PI positiva döda celler.
- Använda cytometern programvara, på "Global Blad" fönstret, klicka på "Dot Plot" och skapa ett diagram på den globala kalkylbladet. På samordna, med ett högerklick, välj blå Hoechst-A och på abskissan, röd Hoechst-A. Med ett högerklick på befolkningen, välj "Visa population" och P1. På denna punktdiagram, skapa en region (P2) för att välja de negativa Hoechst färgämne sido befolkning (SP) celler som visas som en sidoarm till vänster om huvud population av celler (Figur 1C).
- Analysera provet "Hoechst" och samla 10.000 händelser. För att säkerställa att grinden P2, som representerar SP befolkningen, är väl positionerat, analysera provet "Hoechst och Verapamil" (10000 händelser)att observera försvinnandet av SP populationen (figur 1D).
- Samla SP Hoechst färgämne negativa celler i ett 15 ml rör innehållande 1 ml CM-CSC framställda i 1.1.1.1.
- Vid slutet av cellsortering, centrifugera cellsuspensionen vid 250 x g under 5 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten med 1 ml CM-CSC. Räkna antalet sorterade celler med användning av en cellräknare och överföra lämpligt antal celler till en odlingskolv (se tabell 1). Lägga CM-CSC och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 atmosfär.
- Behåll celler i odling under samma betingelser för högst 2 passager tills det finns minst 5 x 10 7 celler (se steg 3, "Cell odlingsmetod").
- Utföra Hoechst negativ cell separation på en flödescytometri sorterare med följande parametrar: UV-laser (355 nm), 2 detektorer på UV laserbanan med blå Hoechst (450/50 BP) och röd Hoechst (610/20 BP) filter, och 2 samlare.
2. Val av CD44 hög / ALDH hög under befolkningen i Side befolknings Sorterade
- Färgning 50 miljoner av SP Celler med ALDH Detection Kit och CD44 Antibody.
- Förbered sju 15 ml sterila rör märkta enligt följande: "Obehandlat" (Tube a), "CD44-APC" (Tube b), "IgG1-APC" (Tube c), "ALDH" (Tube d), "ALDH och DEAB "(Tube e)," ALDH och CD44-APC "(Tube f)," ALDH, DEAB och CD44-APC "(Tube g). Håll alla slangar och reagens vid 4 ° C under färgningen.
- Förbered buffert A med 4,5 ml av bufferten en (ingår i satsen) och 45 pl CD44-APC (allofykocyanin) antikropp (utspädning 1: 100). Förbered buffert B med 100 pl buffert 1 och 1 pl IgG1-APC-antikropp (utspädning 1: 100). Förbereda buffert C med 4 ml buffert 1 och 20 fil av reagenset av satsen.
- Bered en cellsuspension av de tidigare sorterade celler (steg 1.2.5) på 10 7 celler / ml. Tillsätt 100 | il (10 6 celler) av cellsuspensionen till rören a, b och c, och 4 ml (4 x 10 7 celler) till röret f. För tillfället inte sätta celler i provrör d, e och g.
- Centrifugera rören som innehåller cellerna vid 250 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten och suspendera pellets i rören a, b och c i 100 pl buffert 1. Tillsätt 5 pl diethylaminobenzaldehyde (DEAB), en ALDH inhibitor till rör e och g.
- Resuspendera cellerna i röret F med 4 ml reagens C och omedelbart överföra 100 fil till rör d, e och g. Inkubera alla rör i ett vattenbad vid 37 ° C under 30 minuter och att skydda mot ljusexponering med hjälp av aluminiumfolie. Blanda cellsuspensionen försiktigt genom att vortexa efter 15 min för att förhindra celler från att landa.
- Från detta ögonblick, hålla rören på is och skyddas från direkt ljusexponering med hjälp av aluminiumfolie. Centrifugera alla rören vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C och avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera röret f i 4 ml och rör B och G med 100 pl av buffert A. Resuspendera röret C med 100 | il av buffert B. Till de övriga rören, tillsätt 100 | il av buffert 1. Inkubera 10 min vid 4 °; C.
- Centrifugera alla rören vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C och avlägsna supernatanten. Skölj en gång med 1 ml av buffert 1 (4 ml för röret f) och centrifugera igen vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten. Återsuspendera röret f pelleten i 4 ml och alla andra rör i 1 ml av buffert 1.
- Överför provlösningar genom 70 um cell silar för att avlägsna aggregat och samla enstaka celler i lämpliga rör för provupptagning på flödescytometer.
- Isolering av CD44 hög / ALDH hög cellpopulationen genom fluorescensaktiverad cellsortering.
- Utför CD44 hög / ALDH hög cellsortering på en flödescytometri sorterare med följande parametrar: Blå laser (488 nm) och röd laser (633 nm), en detektor på den blå laserbanan med en FITC-filter (530/30), en detektor på den röda laserbanan med en APC filter (660/20) och 2 samlare.
- Använda cytometern mjukvaran, klicka på "Dot Plot "(det femte övre högra bilden) för att skapa en FSC-A kontra SSC-ett punktdiagram som beskrivs i avsnitt 1.2.1.2, för att kontrollera cellmorfologi och välj en befolkning som består av enskilda celler med en SSC-W kontra SSC-H punktdiagram.
- Använda cytometern programvara, på "Global Blad" fönstret, klicka på "Dot Plot" och skapa ett diagram på den globala kalkylbladet. På samordna, med ett högerklick, välj APC-A och på abskissan, FITC-A för att välja den dubbla färgade befolkningen. Skapa en grind med hjälp av rör d och e för att välja ALDH höga celler (Figur 2A). Obs: Positiva celler försvinner i rör e behandlades med DEAB (Figur 2B).
- På samma diagram, skapa en andra grind med hjälp av rör b och c för att välja CD44 höga celler (Figur 2C och 2D). Positiva celler försvinner i röret innehållande IgG1-APC. Analysera rör f och g och skapa en tredje port som innehåller CD44 hög / ALDH <sup> höga celler (figur 2E och 2F).
Obs: Om positiva celler förekommer i röret innehållande IgG1-APC (figur 2D), är inte specifik växelverkan mellan celler och APC-färgade antikropp.
- På samma diagram, skapa en andra grind med hjälp av rör b och c för att välja CD44 höga celler (Figur 2C och 2D). Positiva celler försvinner i röret innehållande IgG1-APC. Analysera rör f och g och skapa en tredje port som innehåller CD44 hög / ALDH <sup> höga celler (figur 2E och 2F).
- Samla CD44 hög / ALDH höga celler in i ett 15 ml rör innehållande 1 ml av CM-CSC. Samla också CD44 låg / ALDH låg i en 15 ml rör innehållande 1 ml CM 19. Obs: Förbered CM-CSC som beskrivs i steg 1.1.1.1.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 250 x g under 5 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten med 1 ml av CM-CSC. Räkna antalet sorterade celler.
3. Cell Culture Method
- Efter den dubbel sortering av cellerna såsom beskrivits ovan, plattan de sorterade cellerna i en lämplig odlingskolv (tabell 1) med CM-CSC vid 37 ° C med 5% CO2. Efter 18-24 timmar,kontrollera om cellerna har vidhäftat och ändra odlingsmediet. Ändra odlingsmediet var 3: e dag tills de expanderande kolonier är större än 50% konfluenta.
- Använd lämplig volym av trypsin 0,5 g / L - EDTA (tabell 1) att trypsinize celler från odlingskolven. Inkubera cellerna 3-5 min vid 37 ° C. Tillsätt lämplig volym av CM-CSC (tabell 1) för att stoppa verkan av trypsin.
- Räkna antalet celler som erhållits och plattan 4 x 10 5 celler i en 175 cm odlingskolv med CM-CSC. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2. Vid denna koncentration, kommer celler med en dubbleringstid av 24 h vara 70% konfluenta i 7 dagar.
- Använd CSCs för in vitro eller in vivo-experiment innan de har genomgått 3 passager.
4. Bekräftelse av tumörpotential och CSC Egenskaper
- Tumör Sphere Formation för att bekräfta tumören potentialen av CD44 hög / ALDHhöga celler.
- Trypsinize celler som beskrivs i 3.2. Lägg 1 x 10 6 celler till en 15 ml rör och centrifugera vid 250 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i en DMEM: F12 (3: 1) medel FCS fri, 20 ng / ml av rhEGF, 4 mg / L av heparin och 1x B27. Inkubera celler i en 6 väl lågt förankringsplattor odlingskolv vid 37 ° C och 5% CO2.
Notera: Använd DMEM: F12 (3: 1) medium innehållande 5% FCS, 20 ng / ml av rhEGF, 4 mg / I av heparin och 1x B27 om cellen inte växer utan FCS. - Observera tumör sfär bildning med ett optiskt mikroskop från 4 till 10 dagar efter ympning (Figur 3A).
Obs: Tumör sfär diameter bör vara mer än 35 pm. CD44 höga / ALDH höga celler kommer att visa en snabbare och mer förbättrad tumör sfär bildning i fråga om antal och storlek jämfört med CD44 låg / ALDH låg.
- Trypsinize celler som beskrivs i 3.2. Lägg 1 x 10 6 celler till en 15 ml rör och centrifugera vid 250 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i en DMEM: F12 (3: 1) medel FCS fri, 20 ng / ml av rhEGF, 4 mg / L av heparin och 1x B27. Inkubera celler i en 6 väl lågt förankringsplattor odlingskolv vid 37 ° C och 5% CO2.
- Utvärdering av in vivo Tumörframkallande EfterSubkutan injektion av CD44 höga / ALDH höga celler i NOD-SCID möss.
- Efter sortering, återsuspendera cellerna i PBS vid tre olika koncentrationer (10 4 celler / ml, 10 5 celler / ml, och 10 6 celler / ml). Injicera subkutant 100 pl 10 4 celler / ml (10 3 celler) i den högra flanken regionen 6 möss. Gör samma sak för 10 5 celler / ml (10 4 celler), och 10 6 celler / ml (10 5 celler).
Notera: Lägre utspädning än 10 3-celler kan testas. - Injicera samma koncentration av CD44 låg / ALDH låg celler i den vänstra flanken regionen. Övervaka injicerade möss i upp till 10 veckor för att se tumörprogression 19.
- Efter sortering, återsuspendera cellerna i PBS vid tre olika koncentrationer (10 4 celler / ml, 10 5 celler / ml, och 10 6 celler / ml). Injicera subkutant 100 pl 10 4 celler / ml (10 3 celler) i den högra flanken regionen 6 möss. Gör samma sak för 10 5 celler / ml (10 4 celler), och 10 6 celler / ml (10 5 celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isoleringen av CSCs från HNSCC cellinjer krävs två på varandra följande sorterings på grund av den mycket låga procentandelen av CSCs i modercellinjen. Den första sorterings var baserad på förmågan hos CSCs att utesluta Hoechst färgämne på grund av läkemedelsflödes transportörer. Detta resulterade i förvärvet av 1-5% av den totala cellpopulationen sorterade (Figur 1). Under Hoechst färgämne negativa cellsortering, kontrollera storleken och granulering av sorterade celler genom att titta på FSC-A kontra SSC-A punktdiagram (figur 1A). Sedan diskriminera dubletter och celler fragment med hjälp av SSC-W kontra SSC-H punktdiagram och välja befolkningen P1 (Figur 1B). På denna P1 befolkning, skapa en Hoechst Röd-A kontra Hoechst Blue-ett punktdiagram. Med röret märkt "Hoechst" visas SP som en sidoarm till vänster från huvud celler populationen (Figur 1C). Denna befolkning måste försvinna när de are behandlades med Verapamil (figur 1D), en hämmare av ABC-transportörer. PI färgning tillåter uteslutning av PI-positiva döda celler, eftersom denna patientgrupp är under skala på Hoechst röda En skala (Figur 1C och 1D, blå ellipser).
Den andra cellsortering var baserad på hög expression av CD44-receptorn och hög ALDH enzymaktivitet som tillät förvärvet av 0,5-2% från SP celler som tidigare sorterade (Figur 2). Innan sortering har olika kontroller används. De första är "ALDH" och "ALDH + DEAB" rör som behövs för att placera den första porten på FITC höga celler (figurerna 2A och 2B): ALDH höga celler gated på FITC-A kontra APC-En punkt plot med hjälp av "ALDH" rör (Figur 2A). Den goda position porten kontrollerades med hjälp av "ALDH + DEAB "tube.. Som DEAB hämmar ALDH måste positiva celler försvinna från porten (Figur 2B) Om de inte ändrar reaktionsbetingelserna (genom att öka mängden av DEAB till exempel) är den andra styr" CD44-APC "och" IgG1-APC "rör som tillåts att placera den andra porten på APC höga celler (figurerna 2C och 2D) med hjälp av celler som färgats med CD44-APC-antikropp (figur 2C). Denna befolkning måste försvinna med kontrollröret som innehöll IgG1-APC-celler (figur 2D). Om det inte gör det, är bindningen med antikroppen inte är specifika och BSA 0,5% bör läggas i buffert 1 från ALDH detekteringssatsen under antikroppsreaktion. Slutligen, den tredje kontroll gäller "ALDH och CD44-APC" rör och "ALDH, DEAB och CD44-APC" rör (figur 2E, 2F, 2G och 2H). dubbel STAining ALDH / CD44 röret används för att placera den sista porten på den dubbla positiva celler (Figur 2E) och samma rör behandlades med DEAB är en kontroll för att verifiera att ALDH höga celler försvinner (Figur 2F).
Detta protokoll används för att sortera CSCs från SQ20B och cellinjerna Fadu. När sorteringen sker för första gången på en ny cellinje, i syfte att säkerställa att sorterade celler har stam-liknande celler egenskaper, är det nödvändigt att bekräfta sin tumör potential. En av stammen liknande cell egenskap är dess förmåga att bilda tumorspheres in vitro i en FSC fritt medium. Under detta förhållande kan bara cancer stamceller liknande celler överlever och prolifererar (figur 3A). Dessutom qPCR experiment visar en hög expression av β-catenin (markör för stammen liknande karakteristik) i CD44 höga / ALDH höga celler (figur 3B), såväl som BMI-1 och Notch 19 </ Sup>. Slutligen, CD44 hög / ALDH höga celler har även möjlighet att bilda tumörer när de injiceras i små mängder jämfört med CD44 låg / ALDH låg celler 19.
Figur 1: Isolering av en sida befolkning exklusive Hoechst färgämne (A) FSC-A kontra SSC-A punktdiagram.. (B) SSC-W kontra SSC-H punktdiagram. (C, D) Hoechst Röd-A kontra Hoechst Blue-ett punktdiagram med "Hoechst" rör (C) eller med "Hoechst och Verapamil" rör (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Så rting av CD44 höga / ALDH höga celler från Hoechst färgämne negativa celler. FITC-A kontra APC-ett punktdiagram med "ALDH" rör (A), den "ALDH + DEAB" röret (B), den "CD44-APC" röret (C), varvid "IgG1-APC" rör (D), den "ALDH och CD44-APC" rör (E och G) eller den "ALDH, DEAB och CD44-APC" rör (F och H). Figurerna A, B, C, D, E och F erhölls med användning SQ20B cellinje. Siffror G och H erhålles med användning Fadu cellinje. Grönt anger CD44 låg / ALDH låg celler (Q3); mörkblå indikerar CD44 låg / ALDH höga celler (Q1); lila indikerar CD44 hög / ALDH låg celler (Q4); ljusblå indikerar CD44 hög / ALDH höga celler (Q2)._upload / 53.958 / 53958fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Bekräftelse av tumörpotential CD44 höga / ALDH höga celler Sorterade CD44 höga / ALDH höga celler kunde bilda tumorspheres in vitro (A) i en dålig FCS media. Skalstock, 25 | j, m. Vidare CD44 hög / ALDH hög uttrycker β-catenin, en markör för tumörbildning (B). Denna kvantifiering har utförts av qPCR och felstaplar representerar SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antal cellersorterad | Odlingskolv typ | Trypsin Volym (ml) | Odlingsmedium Volym (ml) |
| 10,000-200,000 | En brunn i en 6-brunnsplatta eller en 3,5 cm petriskål | 0,5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | En T25 odlingskolv | 1 | 4 |
| > 1000000 | En T75 odlingskolv | 2 | 10 |
Tabell 1: Kultur kolv som ska användas i enlighet med det antal celler sorterade Detaljer om odlingskolv storlek för ungefärligt antal celler sorterade ges.. Volymen av trypsin och volym av medium som krävs för den typ odlingskolv finns också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för att framgångsrikt isolera CSCs från en specifik cellinje som är tillämpbar på andra HNSCC cellinjer. Isolerade huvud- och hals CSCs lämpar sig sedan för ytterligare molekylär karakterisering in vitro och funktionell validering av transplantation i immundefekta möss 19. Dock kan vissa modifieringar testas beroende på den sida populationen eller de CD44 hög / ALDH höga procentandelar som är närvarande i den parentala cellinjen. Till exempel, om den procentuella andelen celler i sidan befolkningen är för låg i en speciell cellinje, kan utföras CD44 hög / ALDH hög sortering direkt. Markörerna som används i denna studie kan ersättas av andra markörer är lämpliga för cellinje studerade såsom CD133 hög 34 eller CD10 hög 35.
Detta protokoll är baserad på två cellsorteringar. Tre färg sortering med SP + CD44 + ALDH var inte possible med de testade cellinjerna. Först, de parentala cellinjer testas här närvarande mindre än 5% av SP och mindre än 10% CD44-hög / ALDH höga celler i SP. Därför SP / CD44 hög / ALDH representerar hög mindre än 0,5% av den parentala cellinjen. Därför är det nödvändigt med en första SP sortering för att berika befolkningen i CD44 höga och / eller ALDH höga celler. För det andra, för att sortera 1% av modercellinjen, det tar fem timmar att få cirka 300.000 celler. Därför, om en tre färgcellsortering görs, kommer mängden av celler som samlats vara mycket låg. Dessutom längre sorteringen rekommenderas inte eftersom det kan påverka cellernas livskraft.
På grund av selektivitet denna isolering protokoll, är den största begränsningen litet antal CSCs erhållits. Det kan vara problematiskt att utföra ytterligare experiment, eftersom det inte rekommenderas att använda dem efter 3 passager på grund av den snabba förlusten av CD44 och ALDH markörer. Vidare före varje nytt experiment, andelen CD44 hög / ALDH hög celler fortfarande närvarande i cellsuspensionen bör testas för att kontrollera antalet CSCs som har differentierade.
Det är viktigt att förbereda Verapamil hydrokloridlösning och odlingsmedium innehållande EGF strax före användning eftersom dessa molekyler är mycket instabil. En förrådslösning av EGF vid 20 mg / L är stabil under tre månader vid -20 ° C. Variationer av Hoechst-protokollet finns, men den slutliga färgämneskoncentrationen som ofta används är 5 | j, g / ml. Dessutom under den första sorterings, olika odlingsmedier kompositioner bör testas i enlighet med den använda cellinjen. När sorterings villkor valideras, är det nödvändigt att kontrollera egenskaperna hos den sorterade cellpopulationen med hjälp av olika metoder (avsnitt 4).
Cellytmarkörer, ALDH-aktivitet och förmåga att efflux vitala färgämnen har redan använts individually i litteraturen för att isolera CSCs från HNSCC. Emellertid det protokoll som beskrivs här har den unika fördelen med att använda kombinationer av olika markörer i syfte att uppnå hög specificitet i CSCs isolering från HNSCC cellinjer. Dessutom CD44 sortering skulle kunna realiseras med en antikropp anti-CD44 konjugerad med magnetiska mikropärlor och sorteras med en magnetisk spalt 36, men denna metod är endast tillämplig på cellytmarkörer och kan inte användas för en ALDH sortering, förhindra dubbel sortering . En annan metod som används för att erhålla CSCs är tumorsphere kultur från primära tumörer 37 eller xenotransplantat 38. Men förvärvet av dessa primära tumörer eller xenotransplantat i samband med etiska restriktioner.
Eftersom denna metod isolerar viabla HNSCC CSCs, kan de användas (efter kontroll av deras tumorigenicitet) i ett antal experiment som mäter den fysiologiska funktionen hos dessa celler. Den tillåter därför behandlar beteendeav CSCs efter olika terapeutiska metoder (strålbehandling, kemoterapi). Det gör det också möjligt att studera olika biologiska parametrar såsom migration / invasion, DNA-reparation, cellsignalering, osv. Därför erhålla CSCs från olika cellinjer är ett attraktivt val för att utreda CSCs egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , BD Biosciences. (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
