Abstract
Trotz der Fortschritte im Verständnis von Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinome (HNSCC) Progression, die Fünf-Jahres-Überlebensrate niedrig bleibt aufgrund der lokalen Rezidiven und Fernmetastasen. Eine Hypothese diese Wiederholung zu erklären, ist das Vorhandensein von Krebs stielartigen Zellen (CSCs), die mit inhärenten Chemo- und Radioresistenz vor. Um neue therapeutische Strategien zu entwickeln, ist es notwendig, experimentelle Modelle zu haben, die die Wirksamkeit von gezielten Behandlungen zu validieren und somit zuverlässige Methoden zur Identifizierung und Isolierung von CSCs zu haben. Zu diesem Zweck stellen wir ein Protokoll für die Isolierung des CSCS aus humanen HNSCC Zelllinien, die auf der Kombination von zwei aufeinanderfolgenden Zell Sortierungen durchgeführt durch Fluoreszenz-aktivierte Zell beruht Sortierung (FACS). Die erste ist auf dem Grundstück von CSCs basiert überexprimiert ATP-Binding Cassette (ABC) Transporterproteine und damit ausschließen, unter anderem lebenswichtige DNA-Farbstoffe wie Hoechst 33342. Die Zellen mit th sortiertwird Verfahren werden als "Side Population" (SP) identifiziert. Da die SP-Zellen einen geringen Anteil (<5%) der parentalen Zellen darstellen, eine Wachstumsphase erforderlich, um ihre Anzahl vor dem zweiten Zellsortierung zu erhöhen. Der nächste Schritt ermöglicht die Selektion von Zellen , die zwei anderen HNSCC Stammzelleigenschaften wie zB hohe Expressionsniveau der Zelloberflächenmarker CD44 (CD44 hoch) und die Überexpression von Aldehyd - Dehydrogenase (ALDH hoch) besitzen. Da die Verwendung eines einzigen Marker zahlreiche Einschränkungen und Gefahren für die Isolierung von CSCs hat, liefert die Kombination von SP, CD44 und ALDH-Marker ein nützliches Werkzeug, um CSCs für weitere analytische und funktionelle Assays erfordern lebenden Zellen zu isolieren. Die stielartigen Eigenschaften des CSCS wurde schließlich in vitro durch die Bildung von tumorispheres und die Expression von β-Catenin validiert.
Introduction
Kopf und Hals Plattenepithelkarzinom (HNSCC) ist eine häufige Malignität weltweit und trotz der Fortschritte bei laufenden Behandlungen, Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung haben eine schlechte Prognose. Die insgesamt 5-Jahres-Überlebensrate des Patienten liegt bei etwa 30% trotz der Kombination von therapeutischen Ansätzen, einschließlich der Operation, Chemo-Strahlentherapie und gezielte-Therapien. Jüngste Studien Attribut Lokalrezidiv und Fernmetastasen auf das Überleben von Krebsstielartigen Zellen (CSCs) im Anschluss an Anti - Krebs - Therapien 1. Es gibt vermehrt Beweise für die Existenz von präsentierenden Zellen Stammzellen Eigenschaften (undifferenzierten Status, Selbsterneuerung und Differenzierung Kapazitäten und Telomerase - Aktivität) in verschiedenen soliden Tumoren wie Brust-, Hirn-, Prostata-, Lungen-, Dickdarm-, Pankreas, Leber und Haut unterstützen 2- 10. Jedoch bleibt der Ursprung des CSCS unklar 11,12. Sie können sich von der malignen Transformation von normalen Stammzellen 3,13 oder dedifferen führenhandlungen von Tumorzellen , die 14,15 CSCs-ähnliche Funktionen zu erwerben. Daher unverwechselbare Wege Verständnis zu CSCs Zusammenhang wird Einblick in die frühe Diagnose und Behandlung von resistenten HNSCC bieten.
Es wurde vorgeschlagen , dass CSCs auch resistent Phänotypen besitzen , die Standard - Chemotherapie und Strahlentherapie entziehen, was zu einer Tumorrückfall im Vergleich zu der Masse der Tumorzellen 16-19 und sind lokalisiert in hypoxischen Nischen 20. Zahlreiche Faktoren haben diese Widerstände von CSCs, wie Neigung zur Ruhe, erhöhte DNA - Reparatur, hochreguliert Zellzyklus - Kontrollmechanismen und Radikalfänger 21 zu erklären vorgeschlagen. Darüber hinaus können mehrere onkogene molekularen Wege speziell in CSCs 17 aktiviert werden. Um weitere gezielte-Therapien Wissen von CSCs zu verbessern, brauchen wir zuverlässige Methoden zur Identifizierung und Isolierung von CSCs, ist wegen der Heterogenität der Stammzellbezogenen Marker inverschiedene Arten von Krebserkrankungen 22.
In HNSCC, stielartigen Tumor-initiierenden Zellen von primären Patienten Tumoren isoliert wurden durch Zellen, die unterschiedliche CSC - Biomarker (wie Drogen Efflux - Transporter Ausdruck 23, CD44 hoch, CD24 niedrig CD133 hoch, c-Met + Phänotyp 10,24 Sortierung, 25 oder ALDH hohe Aktivität 26) oder primären Patiententumor Kultivierung squamospheres zu bilden , die CSC - Eigenschaften haben. Dennoch nimmt die Anzahl der squamospheres dramatisch nach zwei Durchgängen, so dass eine kleine Stichprobengröße für die weitere Charakterisierung geben 27 studiert. Daher werden in - vitro - Assays von etablierten Zelllinien beginnt , ist eine einfachere Lösung Experimente zu entwerfen , um Wissen von CSCs zu verbessern.
Das Ziel dieses Artikels ist es, ein Verfahren vorzuschlagen CSCs von HNSCC Zelllinien multiparametrischer durchflusszytometrische Analyse ein zu isolierennd Zellsortierung. Die Expression von CD44 in Korrelation mit mehreren CSCs Eigenschaften einschließlich ALDH-Aktivität, Side Population (SP) Phänotyp, sind Sphäroidformation Fähigkeit und tumorigenicity verwendet, um dieses Subpopulation von CSCs zu isolieren und zu charakterisieren. CD44 ist ein Zelloberflächen-Glycoprotein, ist in der Zelladhäsion und Migration beteiligt. CD44 wird in hohem Grade in vielen soliden Tumoren CSCs 28 ausgedrückt, auch in Kopf- und Halskrebs Modelle 29-31. Darüber hinaus können CD44 hohe Zellen in vivo einen heterogenen Tumor während CD44 niedrigen Zellen erzeugen kann nicht 10. Der SP - Test wird auf dem Differenzpotential von Zellen auf der Basis des Hoechst - Farbstoff 22 über die ATP-bindenden Kassette (ABC) Familie von Transporterproteine überexprimiert in der CSC - Membran zu Ausströmen. Dieser Test umfasst die Verwendung von ABC-Transporter-Inhibitoren wie Verapamil in Kontrollproben. Aldehyddehydrogenase (ALDH) ist ein intrazelluläres Enzym, das bei der Umwandlung von Retinol beteiligt ist zu retinoic Säure während der frühen Differenzierung von Stammzellen 25,26. Die Zellen , die hohe ALDH Aktivität zeigen stielartigen Zellverhalten in HNSCC 26 und eine sehr geringe Anzahl von ALDH hohe Zellen zeigen können Tumoren in vivo 26,32 zu erzeugen.
Die Kombination dieser Marker und die Eigenschaften wurde erfolgreich von Bertrand e t al. , Den Widerstand in vitro zu untersuchen und in vivo dieser CSCs zu Photonen- und Kohlenstoffionenstrahlung 19. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die Kombination von verschiedenen Zellmarkern und Eigenschaften sind selektiver für nützliche Untersuchungen über HNSCC CSCs Populationen als single-Marker Ansätze.
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Protocol
Alle Tier Verfahren wurden nach den örtlichen Richtlinien für die Tierpflege durchgeführt. Alle Details dieser Studie wurden von der CECCAPP genehmigt, eine Französisch Ethikkommission.
1. Auswahl eines Side Population (SP) von der Hoechst Dye Efflux Assay
- Das Anfärben 50 Millionen Zellen mit Hoechst 33342 Farbstoff.
- Bereiten zwei 15 ml sterile Röhrchen mit konischem Boden: ein Rohr mit "Hoechst" und eine Bezeichnung "Hoechst und Verapamil". Bereiten Sie 10 ml 5 mM Verapamil-Hydrochlorid-Lösung in sterilem Wasser. Bereiten Sie das Kulturmedium (CM) für Stammzellen.
- Zur Herstellung von CM für CSC (CM-CSC), vereinige die folgenden: Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% fötales Kälberserum (FCS), 0,04 mg / l Hydrocortison , 100 U / ml Penicillin, 0,1 g / l Streptomycin und 20 ug / L des epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR).
- Unter einem Laminar-Flow-Haube, trypsinize Zellen. Entfernen Sie das Medium, waschen mit sterile phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 1 ml Trypsin-EDTA (0,5 g / L) für einen 75 cm²-Kolben. Inkubieren 3 min bei 37 ° C. Die Reaktion durch Zugabe von Kulturmedium für die elterliche Zelllinie verwendet. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zellzähler.
- Um CM für die elterliche Zelllinie (CM-P) vorbereiten, ergänzen DMEM mit 10% FCS, 0,4 mg / l Hydrocortison, 100 U / ml Penicillin und 0,1 g / l Streptomycin).
- Verdünne die Zellsuspension in dem Schritt 1.1.2 erhaltenen 10 7 Zellen / ml in CM-P zu erhalten. Spaltete die Zellsuspension in den 2 Röhrchen hergestellt: setzen 100 ul (10 & sup6 ; Zellen) in dem Rohr "Hoechst und Verapamil" und 4 ml (4 x 10 7 Zellen) in dem Rohr "Hoechst".
- In der Probe "Hoechst und Verapamil", mit 10 ul 5 mM Verapamil-Hydrochlorid-Lösung (Endkonzentration: 0,5 mM) und vorsichtig mischen. Zugabe von 5 & mgr; l von 1 g / L Hoechst-Lösung (Endkonzentration: 0,1 g / L). In der Probe & #34; Hoechst ", fügen Sie 5 ul 1 g / l Hoechst Lösung pro 10 6 Zellen (200 ul insgesamt) Fortan halten Proben vor direkter Lichteinwirkung geschützt Aluminiumfolie..
- Inkubieren Alle Röhrchen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 1 h 30 min. Vorsichtig mischen alle 15 min zu verhindern, dass Zellen aus sesshaft.
- Zentrifugenröhrchen bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und resuspendieren jedes Pellet mit 2 ml 1x PBS.
- Zentrifugenröhrchen bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen. Resuspendieren "Hoechst und Verapamil" Pellet in 500 & mgr; l von 5 mg / L Propidiumiodid (PI) in PBS-Puffer verdünnt und "Hoechst" Pellet in 4 ml von 5 mg / L PI verdünnt in PBS-Puffer.
- Übertragen Probenlösungen durch einen 70 & mgr; m Zellsieb Aggregate zu entfernen und einzelne Zellen in Röhrchen für die Probenaufnahme auf dem Durchflusszytometer zu sammeln. Halten Sie Proben auf Eis und schützen vor direkter Lichteinwirkung Aluminiumfolie.
- Bereiten zwei 15 ml sterile Röhrchen mit konischem Boden: ein Rohr mit "Hoechst" und eine Bezeichnung "Hoechst und Verapamil". Bereiten Sie 10 ml 5 mM Verapamil-Hydrochlorid-Lösung in sterilem Wasser. Bereiten Sie das Kulturmedium (CM) für Stammzellen.
- ichsolation der Side Population von Zellsortierung Ohne Hoechst-Farbstoff.
- Führen Hoechst negative Zell Trennung auf einer Durchflusszytometrie Sortierer mit den folgenden Parametern: UV-Laser (355 nm), 2 Detektoren auf dem UV-Laser-Pfad mit blauen Hoechst (450/50 BP) und rot Hoechst (610/20 BP) Filter und 2 Sammler.
- Zunächst analysieren Probe "Hoechst", die für die Färbung und Durchflusszytometer Set-up als eine positive Kontrolle dient.
- Mit Hilfe der Zytometer-Software, auf der "Globalen Arbeitsblatt" Fenster, klicken Sie auf "Dot Plot" (fünftes Bild rechts oben) und ein Diagramm auf dem globalen Arbeitsblatt erstellen. Auf Ordinate, mit einem Rechtsklick, wählen Sie FSC-A (Vorwärtsstreuung) und Abszisse, SSC-A (Seitenstreuung) (Abbildung 1A). In der gleichen Weise, ein SSC-W im Vergleich zu SCC-H-Punktediagramm erstellen. Auf dieser zweiten Punktdiagramm, eine P1 - Region zu erstellen, klicken Sie auf "Polygon gate" (vierzehnten Bild rechts oben) (Abbildung 1B) 33.
Hinweis: Der P1 Regioneinzelne Zellen umfassen und Dubletten zu unterscheiden. - Optional: Ausschließen PI-positiven Zellen durch eine FSC-A im Vergleich zu PI auf P1 gated zu schaffen. Auf dieser Punktdiagramm, wählen Sie die PI-negativen Population (P2) PI positive tote Zellen auszuschließen.
- Mit Hilfe der Zytometer-Software, auf der "Globalen Arbeitsblatt" Fenster, klicken Sie auf "Dot Plot" und ein Diagramm auf dem globalen Arbeitsblatt erstellen. Auf Ordinate, mit einem Rechtsklick, wählen Sie blau Hoechst-A und Abszisse, rot Hoechst-A. Mit einem Rechtsklick auf die Bevölkerung, wählen Sie "Show Bevölkerung" und P1. Auf dieser Punktdiagramm, erstellen Sie einen Bereich (P2) , die negativen Hoechst - Farbstoff Side Population (SP) Zellen auszuwählen , die auf der linken Seite der Hauptpopulation von Zellen (1C) als Seitenarm erscheint.
- Analysieren Sie die Probe "Hoechst" und 10.000 Ereignisse sammeln. Um sicherzustellen, daß das Gate P2, die die SP Population darstellt, gut positioniert ist, analysieren, um die Probe "Hoechst und Verapamil" (10.000 Ereignisse)das Verschwinden von SP Bevölkerung (1D) zu beobachten.
- Sammeln Sie die SP Hoechst-Farbstoff-negativen Zellen in einem 15 ml-Röhrchen mit 1 ml CM-CSC in 1.1.1.1 vorbereitet.
- Am Ende der Zellsortierung, Zentrifuge die Zellsuspension bei 250 × g für 5 Minuten, entfernen Sie den Überstand und das Pellet mit 1 ml CM-CSC. Zählen Sie die Anzahl der sortierten Zellen mit einem Zellzähler und übertragen entsprechende Anzahl von Zellen zu einer Kulturflasche (siehe Tabelle 1). In CM-CSC und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2 -Atmosphäre.
- Pflegen Zellen in Kultur unter den gleichen Bedingungen für maximal 2 Passagen , bis mindestens 5 x 10 7 Zellen ist (siehe Schritt 3, "Zellkulturverfahren").
- Führen Hoechst negative Zell Trennung auf einer Durchflusszytometrie Sortierer mit den folgenden Parametern: UV-Laser (355 nm), 2 Detektoren auf dem UV-Laser-Pfad mit blauen Hoechst (450/50 BP) und rot Hoechst (610/20 BP) Filter und 2 Sammler.
2. Auswahl des CD44 - hoch / ALDH hohe Subpopulation in der Side Population Sortiert
- Das Anfärben 50 Millionen von SP-Zellen mit dem ALDH Detection Kit und CD44 Antikörper.
- Bereiten sieben 15 ml sterilen Röhrchen wie folgt gekennzeichnet: "Unstained" (a) Das "CD44-APC" (Röhre b) "IgG1-APC" (Röhre c) "ALDH" (U-d), "ALDH und DEAB "(U-e)," ALDH und CD44-APC "(U-f)," ALDH, DEAB und CD44-APC "(Röhre g). Halten Sie alle Rohre und Reagenzien bei 4 ° C während der Färbung.
- Bereiten Puffer A mit 4,5 ml des Puffers 1 (im Kit enthalten) und 45 ul CD44-APC (Allophycocyanin) Antikörper (Verdünnung 1: 100). Bereiten Puffer B mit 100 ul Puffer 1 und 1 ul IgG1-APC-Antikörper (Verdünnung 1: 100). Bereiten Puffer C mit 4 ml Puffer 1 und 20 & mgr; l des Reagenz des Kits.
- Vorbereitung einer Zellsuspension der zuvor sortierten Zellen (Schritt 1.2.5) bei 10 7 Zellen / ml. Füge 100 & mgr; l (10 & sup6 ; Zellen) der Zellsuspension a, b und c zu den Röhrchen und 4 ml (4 x 10 7 Zellen) zu Rohr f. Zur Zeit stellen keine Zellen in Röhrchen d, e und g.
- Zentrifugiere die Röhrchen, die Zellen bei 250 xg für 5 min enthält. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Pellets in Rohren a, b und c in 100 ul Puffer 1. In 5 ul Diethylaminobenzaldehyd (DEAB), eine ALDH-Hemmstoff, um Rohre e und g.
- Die Zellen in Rohr f mit 4 ml Reagenz C und sofort übertragen, 100 & mgr; l in Röhrchen, d, e und g. Inkubieren Alle Röhrchen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min und zum Schutz vor direkter Lichteinwirkung Aluminiumfolie verwendet wird. Mischen Sie die Zellsuspension sanft durch Verwirbelung nach 15 min Zellen zu verhindern Absetzen.
- Von diesem Moment an, halten Sie die Röhrchen auf Eis und vor direkter Lichteinwirkung mit Aluminiumfolie geschützt. Zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 250 g für 5 min bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Rohr f in 4 ml und Röhren b und g mit 100 ul Puffer A resuspendieren Rohr c mit 100 & mgr; l Puffer B. Zu den anderen Röhrchen werden 100 & mgr; l Puffer 1 Inkubiere 10 Minuten bei 4 & deg;; C.
- Zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 250 g für 5 min bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. Spülen einmal mit 1 ml Puffer 1 (4 ml für Rohr f) und zentrifugiert erneut bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. Re-suspendieren Rohr f Pellet in 4 ml und alle anderen Rohre in 1 ml Puffer 1.
- Übertragen Sie die Probenlösungen durch 70 um Zellsiebe Aggregate zu entfernen und einzelne Zellen in geeigneten Röhrchen für die Probenaufnahme auf Durchflusszytometer zu sammeln.
- Die Isolierung des CD44 hoch / ALDH hohe Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting.
- Führen Sie CD44 hoch / ALDH hohe Zelle auf einem Durchflusszytometrie Sortierer mit den folgenden Parametern Sortierung: Blau - Laser (488 nm) und Rot - Laser (633 nm), 1 Detektor auf dem blauen Laser-Pfad mit einem FITC - Filter (530/30), 1 Detektor auf dem roten Laser-Pfad mit einem APC-Filter (660/20) und 2 Sammler.
- Mit Hilfe der cytometer Software, klicken Sie auf "Dot Plot "(das fünfte Bild oben rechts) mit einem FSC-A gegen SSC-A-Dot-Plot zu erstellen, wie in Abschnitt 1.2.1.2 beschrieben, Zellmorphologie zu überprüfen und eine Bevölkerung wählen, bestehend aus einzelnen Zellen mit einem SSC-W gegen SSC-H Punktdiagramm.
- Mit Hilfe der Zytometer-Software, auf der "Globalen Arbeitsblatt" Fenster, klicken Sie auf "Dot Plot" und ein Diagramm auf dem globalen Arbeitsblatt erstellen. Auf Ordinate, mit einem Rechtsklick, wählen APC-A und Abszisse, FITC-A, um die Doppel gefärbten Bevölkerung zu wählen. Erstellen Sie eine Gate - Rohre d und e zur Wahl von ALDH hohe Zellen (2A) verwendet wird . Hinweis: Positive Zellen verschwinden in Rohr e behandelt mit DEAB (2B).
- Auf dem gleichen Chart, erstellen Sie eine zweite Gate - Röhren b und c , um unter Verwendung von CD44 hohen Zellen (2C und 2D) zu wählen. Positive Zellen verschwinden in dem Röhrchen, das IgG1-APC. Analysieren Rohre f und g und schaffen ein drittes Tor , das CD44 - hoch / ALDH enthält <sup> Hoch Zellen (Abbildung 2E und 2F).
Hinweis: Wenn positive Zellen in dem Rohr vorhanden sind , enthält IgG1-APC (2D), die Wechselwirkung zwischen Zellen und der APC-gefärbten Antikörper nicht spezifisch ist.
- Auf dem gleichen Chart, erstellen Sie eine zweite Gate - Röhren b und c , um unter Verwendung von CD44 hohen Zellen (2C und 2D) zu wählen. Positive Zellen verschwinden in dem Röhrchen, das IgG1-APC. Analysieren Rohre f und g und schaffen ein drittes Tor , das CD44 - hoch / ALDH enthält <sup> Hoch Zellen (Abbildung 2E und 2F).
- Sammeln Sie CD44 hoch / ALDH hohe Zellen in einen 15 - ml - Röhrchen mit 1 ml CM-CSC. Sammeln Sie auch CD44 low / ALDH niedrig in einem 15 - ml - Röhrchen mit 1 ml CM 19. Anmerkung: Bereiten CM-CSC, wie in Schritt 1.1.1.1 beschrieben.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 × g für 5 Minuten, entfernen Sie den Überstand und das Pellet mit 1 ml CM-CSC. Zählen Sie die Anzahl der sortierten Zellen.
3. Zellkulturverfahren
- Nach dem zwei Sortierung der Zellen , wie oben beschrieben, bei 37 ° C mit 5% CO 2 die sortierten Zellen in einem geeigneten Kulturkolben (Tabelle 1) mit CM-CSC plattieren. Nach 18 bis 24 Stunden,überprüfen, ob die Zellen anhaften und das Kulturmedium ändern. Ändern des Kulturmedium alle 3 Tage bis die wachsenden Kolonien von mehr als 50% konfluent.
- Verwenden Sie das entsprechende Volumen von Trypsin 0,5 g / l - EDTA (Tabelle 1) Zellen aus der Kulturflasche zu trypsinize. Inkubiere Zellen 3 bis 5 min bei 37 ° C. Fügen Sie das entsprechende Volumen von CM-CSC (Tabelle 1) die Wirkung von Trypsin zu stoppen.
- Zählen der Anzahl von Zellen erhalten wird und die Platte 4 x 10 5 Zellen in einer 175 cm² Kulturflasche mit CM-CSC. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2. Bei dieser Konzentration die Zellen mit einer Verdopplungszeit von 24 h werden nach 7 Tagen 70% konfluent sein.
- Verwenden KSZ für in vitro- oder in vivo - Experimente , bevor sie 3 Passagen unterzogen wurden.
4. Bestätigung der Tumorpotenzial und CSC Merkmale
- Tumor Kugelbildung des Tumors Potential des CD44 - hoch / ALDH zu bestätigenhohe Zellen.
- Trypsinize Zellen, wie in 3.2 beschrieben. 1 x 10 6 Zellen in ein 15 ml - Röhrchen und zentrifugiert bei 250 g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem DMEM: F12 (3: 1) Medium FCS frei, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l Heparin und 1x B27. Inkubiere Zellen in einer 6 - Well - Platten niedrigen Verankerungskulturkolben bei 37 ° C und 5% CO 2.
Anmerkung: Mit DMEM: F12 (3: 1) -Medium, enthaltend 5% FCS, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l Heparin und 1x B27 wenn Zelle wachsen nicht ohne FCS. - Achten Sie auf die Tumorbildung Kugel mit einem optischen Mikroskop von 4 bis 10 Tage nach der Aussaat (3A).
Hinweis: Tumor Kugeldurchmesser sollte mehr als 35 um betragen. CD44 hoch / ALDH hohe Zellen zeigen eine schnellere und verbesserte Bildung Kugel Tumor in Bezug auf die Anzahl und Größe im Vergleich zu CD44 low / ALDH niedrig.
- Trypsinize Zellen, wie in 3.2 beschrieben. 1 x 10 6 Zellen in ein 15 ml - Röhrchen und zentrifugiert bei 250 g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem DMEM: F12 (3: 1) Medium FCS frei, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l Heparin und 1x B27. Inkubiere Zellen in einer 6 - Well - Platten niedrigen Verankerungskulturkolben bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Auswertung von In - vivo - Tumorigenität NachDie subkutane Injektion von CD44 hoch / ALDH hohe Zellen in NOD-SCID - Mäusen.
- Nach dem Sortieren Zellen in PBS bei drei verschiedenen Konzentrationen (10 4 Zellen / ml, 10 5 Zellen / ml und 10 & sup6 ; Zellen / ml) re-suspendieren. Injizieren subkutan 100 & mgr; l von 10 4 Zellen / ml (10 3 Zellen) in dem rechten Flankenbereich von 6 Mäusen. Das gleiche für 10 5 Zellen / ml (10 & sup4 ; Zellen) und 10 6 Zellen / ml (10 5 Zellen).
Hinweis: Lower Verdünnungs als 10 3 Zellen getestet werden kann. - Injizieren Sie die gleiche Konzentration von CD44 low / ALDH niedrigen Zellen in der linken Flankenbereich. Monitor - injizierten Mäusen für bis zu 10 Wochen , um zu sehen Tumorprogression 19.
- Nach dem Sortieren Zellen in PBS bei drei verschiedenen Konzentrationen (10 4 Zellen / ml, 10 5 Zellen / ml und 10 & sup6 ; Zellen / ml) re-suspendieren. Injizieren subkutan 100 & mgr; l von 10 4 Zellen / ml (10 3 Zellen) in dem rechten Flankenbereich von 6 Mäusen. Das gleiche für 10 5 Zellen / ml (10 & sup4 ; Zellen) und 10 6 Zellen / ml (10 5 Zellen).
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Representative Results
Die Isolierung von CSCs von HNSCC Zelllinien benötigt, um zwei aufeinanderfolgende Sortierung wegen des sehr geringen Anteil an CSCs in der elterlichen Zelllinie. Die erste Sortierung wurde auf die Fähigkeit von CSCs Basis des Hoechst-Farbstoff wegen Drogen Efflux-Transporter auszuschließen. Dies resultierte in Erwerb von 1-5% der Gesamtzellpopulation sortiert (Abbildung 1). Während der Hoechst - Farbstoff negativen Zellsortierung, überprüfen Sie die Größe und die Granulation von sortierten Zellen , indem man die FSC-A gegen SSC-A - Punkt - Diagramm (Abbildung 1A). Dann unterscheiden Dubletten und Zellen Fragmente mit dem SSC-W gegen SSC-H Dot - Plot und die Auswahl der Population P1 (1B). ein Hoechst Red-A gegen Hoechst Blau-A-Punkt-Diagramm Auf dieser P1 Bevölkerung schaffen. Mit dem Rohr Bezeichnung "Hoechst", erscheint die SP als Seitenarm auf der linken Seite von der Hauptzellen Population (1C). Diese Population muss verschwinden, wenn sie are Behandlung mit Verapamil (1D), ein Inhibitor der ABC - Transporter. Die PI - Färbung erlaubt den Ausschluss von PI-positiven toten Zellen , da diese Population unter-Skala auf der Hoechst Red-A - Skala (1C und 1D, blaue Ellipsen) ist.
Die zweite Zellsortierung auf die hohe Expression des CD44 - Rezeptor und hohe ALDH - Enzymaktivität wurde auf der Grundlage , welche die Akquisition von 0,5-2% aus den SP - Zellen zuvor sortiert erlaubt (Figur 2). Vor der Sortierung wurden verschiedene Kontrollen verwendet. Die ersten sind die "ALDH" und die "ALDH + DEAB" Röhren benötigt , um das erste Tor zu platzieren auf FITC hohe Zellen (2A und 2B): ALDH hohe Zellen wurden auf dem FITC-A gated gegen APC-A - Punkt Plot der "ALDH" Rohr (2A) verwendet wird . Die gute Position des Tores wurde mit dem "ALD geprüft mitH + DEAB "Röhre:.. Als DEAB ALDH hemmt, positive Zellen aus dem Tor (2B) verschwinden müssen , wenn sie nicht die Bedingungen Reaktion verändern (indem die Menge an DEAB zum Beispiel Erhöhung) Die zweite Steuer ist das" CD44-APC "und" IgG1-APC "Rohre , die das zweite Gate auf APC Hoch Zellen (2C und 2D) unter Verwendung der gefärbten Zellen mit dem CD44-APC - Antikörper (2C) in die Position erlaubt. Diese Population mit dem verschwinden müssen Kontrollröhrchen , die IgG1-APC - Zellen (2D) enthalten sind . Wenn dies nicht der Fall ist, mit dem Antikörper die Bindung ist nicht spezifisch und BSA 0,5% in Puffer 1 bei der Antikörper - Reaktion von dem ALDH - Nachweis - Kit hinzugefügt werden sollte. Schließlich ist die dritte Kontrolle bezieht sich auf die "ALDH und CD44-APC" Rohr und "ALDH, DEAB und CD44-APC" Röhren (2E, 2F, 2G und 2H). die doppelte staining ALDH / CD44 Rohr verwendet wird , das letzte Tor auf der doppelt positiven Zellen (Abbildung 2E) und das gleiche Rohr mit DEAB behandelt zu positionieren ist eine Kontrolle , um zu überprüfen , dass ALDH hohe Zellen verschwinden (2F).
Dieses Protokoll wird verwendet, CSCs vom SQ20B zu sortieren und die FaDu Zelllinien. Wenn die Sortierung zum ersten Mal auf eine neue Zelllinie, geschieht, um zu gewährleisten, dass sortierten Zellen stielartigen Zellen Eigenschaften ist es notwendig, ihre Tumorpotential zu bestätigen. Einer der stielartigen Zelleigenschaft ist die Fähigkeit tumorspheres in vitro in einem FSC freien Medium zu bilden. Unter dieser Bedingung kann nur Krebs stielartigen Zellen überleben und proliferieren (3A). Darüber hinaus zeigen qPCR - Experimente eine hohe Expression von β-Catenin (Marker der stielartigen Charakteristik) in CD44 hoch / ALDH hohe Zellen (3B), sowie Bmi-1 und Notch 19 </ Sup>. Schließlich sind CD44 hoch / ALDH hohe Zellen auch in der Lage Tumoren zu bilden , wenn sie in geringen Mengen injiziert , im Vergleich mit CD44 niedrig / ALDH niedrigen Zellen 19.
Abbildung 1: Isolierung eines Seiten Population mit Ausnahme des Hoechst - Farbstoff (A) FSC-A gegen SSC-A - Dot - Plot.. (B) SSC-W gegen SSC-H Dot - Plot. (C, D) Hoechst Red-A gegen Hoechst Blau-A - Punktediagramm mit der "Hoechst" Rohr (C) oder mit der "Hoechst und Verapamil" Rohr (D). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: So rting von CD44 hoch / ALDH hohe Zellen aus Hoechst - Farbstoff - negativen Zellen. FITC-A gegenüber APC-A - Punkt - Diagramm mit dem "ALDH" Rohr (A), die "ALDH + DEAB" Rohr (B), die "CD44-APC" Rohr (C), die "IgG1-APC" Rohr (D), die "ALDH und CD44-APC" tube (E und G) oder der "ALDH, DEAB und CD44-APC" tube (F und H). Die Zahlen A, B, C, D, E und F wurden erhalten SQ20B Zelllinie verwendet wird. Die Zahlen G und H erhalten FaDu Zelllinie verwendet wird. Grün zeigt an CD44 low / ALDH niedrigen Zellen (Q3); dunkelblau zeigt CD44 low / ALDH hohe Zellen (Q1); lila zeigt CD44 hoch / ALDH niedrigen Zellen (Q4); hellblau zeigt CD44 hoch / ALDH hohe Zellen (Q2)._upload / 53958 / 53958fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Bestätigung der Tumorpotential von CD44 hoch / ALDH hohe Zellen Sortiert CD44 hoch / ALDH hohe Zellen konnten tumorspheres in vitro (A) in einem Armen FCS Medien zu bilden. Maßstabsbalken, 25 & mgr; m. Darüber hinaus CD44 hoch / ALDH hohe überzubetonen β-Catenin, ein Marker für tumorigenicity (B). Diese Quantifizierung wurde von qPCR und Fehlerbalken stellen SD durchgeführt wurden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Anzahl der Zellen,sortiert | Kulturkolben-Typ | Trypsin-Volumen (ml) | Kulturmedium-Volumen (ml) |
| 10.000-200.000 | 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte oder eine 3,5-cm-Petrischale | 0,5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | 1 T25 Kulturflasche | 1 | 4 |
| > 1000000 | 1 T75 Kulturflasche | 2 | 10 |
Tabelle 1: Kulturkolben Typ Verwendung gemäß der Anzahl der Zellen sortiert Einzelheiten der Kulturflasche Größe für die ungefähre Anzahl der Zellen sortiert werden angegeben.. Das Volumen an Trypsin und Volumen des Mediums für die Kulturflasche Typ erforderlich sind ebenfalls vorgesehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode für die erfolgreiche Isolierung von CSCs aus einer bestimmten Zelllinie, die auf andere HNSCC Zelllinien anwendbar ist. Isolierte Kopf und Hals CSCs eignen sich dann für die weitere molekulare Charakterisierung in vitro und funktionale Validierung durch Transplantation in immundefizienten Mäusen 19. Allerdings können einige Änderungen in Abhängigkeit von der Seiten Bevölkerung getestet werden oder die CD44 hoch / ALDH hohen Prozentsatz in der elterlichen Zelllinie. Wenn der Prozentsatz an Zellen in der Seitenpopulation beispielsweise in einer bestimmten Zelllinie zu niedrig ist, kann der CD44 hoch / ALDH hohe Sortier direkt durchgeführt werden. Die Marker in dieser Studie verwendet wird, kann untersucht durch andere Markierungen angebracht, die Zelllinie ersetzt werden , wie beispielsweise CD133 Hoch 34 oder CD10 hoch 35.
Dieses Protokoll basiert auf zwei Zellsortierungen. Drei Farbe mit SP + CD44 + ALDH Sortierung war nicht possible mit den Zelllinien getestet. Zunächst testeten die elterliche Zelllinien hier derzeit weniger als 5% der SP und weniger als 10% CD44 hoch / ALDH hohe Zellen in der SP. Daher SP / CD44 hoch / ALDH hohe repräsentieren weniger als 0,5% der Eltern - Zelllinie. Daher ist eine erste SP Sortierung notwendig , um die Bevölkerung in CD44 hoch und / oder ALDH hohe Zellen zu bereichern. Zweite, 1% der parentalen Zelllinie zu sortieren, dauert es 5 Stunden etwa 300.000 Zellen zu erhalten. Wenn daher eine 3-farbige Zellsortierung durchgeführt wird, wird die Menge von Zellen gesammelt, sehr niedrig sein. Darüber hinaus wird mehr Sortierung nicht empfohlen, da es die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen können.
Aufgrund der Selektivität dieses Trennprotokolls ist die wichtigste Einschränkung die geringe Anzahl von CSCs erhalten. Dies kann problematisch sein, weitere Experimente durchzuführen, da es nicht empfohlen wird, sie nach 3 Passagen zu verwenden wegen der raschen Verlust der CD44 und ALDH-Marker. Darüber hinaus vor jedem neuen Versuch, der Anteil der CD44 hoch / ALDH hohe Zellen noch in der Zellsuspension sollte getestet werden , um die Anzahl von CSCs zu überprüfen , die differenziert hat.
Es ist zwingend notwendig, Verapamil-Hydrochlorid-Lösung und Kulturmedium, das EGF unmittelbar vor Gebrauch herzustellen, wie diese Moleküle sehr instabil sind. Eine Stammlösung von EGF bei 20 mg / L ist für drei Monate bei -20 ° C stabil. Variationen des Hoechst-Protokoll vorhanden sind, aber die endgültige Farbstoffkonzentration verwendet üblicherweise beträgt 5 & mgr; g / ml. Darüber hinaus wird während der ersten Sortierung, sollten unterschiedliche Kulturmedien Zusammensetzungen gemäß der Zelllinie verwendet werden, getestet. Sobald die Sortierbedingungen validiert werden, ist es notwendig, die Eigenschaften der sortierten Zellpopulation mit den verschiedenen Methoden (Abschnitt 4) zu überprüfen.
Zelloberflächenmarker, ALDH-Aktivität und die Fähigkeit, Vitalfarbstoffe zu Ausströmen wurden individua bereits verwendetlly in der Literatur CSCs von HNSCC zu isolieren. Das beschriebene Protokoll hier hat den einzigartigen Vorteil von Kombinationen von verschiedenen Markern, um mit hoher Spezifität in CSCs Isolation von HNSCC Zelllinien zu erreichen. Darüber hinaus kann die CD44 Sortierung könnte mit einem Antikörper , anti-CD44 , konjugiert mit magnetischen Mikrokügelchen und sortiert mit einer magnetischen Spalte realisiert 36, jedoch ist dieses Verfahren nur für Zelloberflächenmarker und kann nicht für eine ALDH Sortieranlage verwendet werden, Doppelsortier Verhindern . Ein weiteres Verfahren verwendet CSCs zu erhalten , ist die tumorsphere Kultur von Primärtumoren 37 oder Xenotransplantate 38. Allerdings sind der Erwerb dieser primären Tumoren oder Xenotransplantate mit ethischen Einschränkungen verbunden.
Da dieses Verfahren tragfähige HNSCC CSCs Isolate, können sie (nach Überprüfung ihrer Tumorigenität) in einer Reihe von Experimenten, die die physiologische Funktion dieser Zellen gemessen werden. Es ermöglicht daher Bewertung des Verhaltensvon CSCs nach verschiedenen therapeutischen Ansätzen (Strahlentherapie, Chemotherapie). Es ermöglicht auch die Untersuchung verschiedener biologischer Parameter wie Migration / Invasion, DNA - Reparatur, Zellsignalisierung, etc. Daher CSCs aus verschiedenen Zelllinien zu erhalten, ist eine attraktive Wahl für CSCs Eigenschaften zu untersuchen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
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