Abstract
Malgré les progrès dans la compréhension de la tête et du cou carcinomes épidermoïdes (CETC) progression, le taux de survie à cinq ans reste faible en raison de la récidive locale et des métastases à distance. Une hypothèse pour expliquer cette récurrence est la présence de cellules souches comme le cancer (CCM) qui présentent une chimio- inhérente et radio-résistance. Afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire d'avoir des modèles expérimentaux qui valident l'efficacité des traitements ciblés et donc de disposer de méthodes fiables pour l'identification et l'isolement des CSC. A cette fin, nous présentons un protocole pour l'isolement des cellules souches cancéreuses à partir de lignées cellulaires humaines HNSCC qui repose sur la combinaison de deux tries successives de cellules réalisées par cellules activées par fluorescence (FACS). La première est basée sur la propriété de CSCs à surexpriment ATP-Binding Cassette (ABC) protéines de transport et donc exclure, entre autres, des colorants d'ADN vitaux tels que Hoechst 33342. Les cellules triées avec eest la méthode sont identifiés comme une «population de côté» (SP). Étant donné que les cellules SP représentent un pourcentage faible (<5%) des cellules parentales, une phase de croissance est nécessaire afin d'augmenter leur nombre avant le second tri cellulaire. L'étape suivante permet la sélection des cellules qui possèdent deux autres caractéristiques de cellules souches de CETC -à- dire de haut niveau du marqueur de surface cellulaire CD44 (CD44 haute) et la surexpression de l' aldéhyde déshydrogénase (ALDH haute) expression. Depuis l'utilisation d'un marqueur unique a de nombreuses limites et les pièges pour l'isolement des cellules souches cancéreuses, la combinaison de SP, CD44 et des marqueurs de l'ALDH fournira un outil utile pour isoler CSCs pour d'autres essais analytiques et fonctionnelles nécessitant des cellules viables. Les caractéristiques de souches comme des cellules souches cancéreuses a finalement été validés in vitro par la formation de tumorispheres et l'expression de β-caténine.
Introduction
Tête et cou épidermoïde carcinome (CETC) est une tumeur maligne commune dans le monde entier et malgré les progrès réalisés dans les traitements actuels, les patients ayant une maladie avancée ont un mauvais pronostic. Le taux de survie à 5 ans globale du patient est d'environ 30%, malgré la combinaison d'approches thérapeutiques, y compris la chirurgie, chimio-radiothérapie et-thérapies ciblées. Des études récentes attribuent une récidive locale et de métastases à distance à la survie des cellules souches comme le cancer (CSC) suivant des thérapies anticancéreuses 1. Il y a accumulation de preuves étayant l'existence de cellules présentant des cellules souches propriétés (capacités état indifférencié, auto-renouvellement et de différenciation, et l' activité de la télomérase) dans diverses tumeurs solides , y compris du sein, du cerveau, de la prostate, du poumon, du côlon, du pancréas, du foie et de la peau 2- 10. Cependant, l'origine de CSCs reste incertaine 11,12. Ils peuvent résulter de la transformation maligne des cellules souches normales 3,13 ou dedifferenciation des cellules tumorales qui acquièrent des caractéristiques telles que CCM-14,15. Par conséquent, la compréhension des voies distinctes relatives à CSCs permettra de mieux comprendre le diagnostic et le traitement des CETC résistant tôt.
Il a été proposé que les cellules souches cancéreuses possèdent également des phénotypes résistants qui soustraient chimiothérapie et la radiothérapie classique, ce qui entraîne une rechute de la tumeur par rapport à la masse des cellules tumorales et 16-19 sont localisées dans des niches 20 hypoxique. De nombreux facteurs ont été proposés pour expliquer ces résistances de CSCS, tels que la propension à quiescence, amélioré la réparation de l' ADN, des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire régulés à la hausse, et de balayage des radicaux libres 21. En outre, plusieurs voies moléculaires oncogéniques peuvent être spécifiquement activées dans CSCs 17. Afin d'améliorer la connaissance des CSC pour-thérapies ciblées en outre, nous avons besoin de méthodes fiables pour l'identification et l'isolement des CSCs, en raison de l'hétérogénéité des marqueurs liés à des cellules souches dansdivers types de cancers 22.
En CETC, cellules souches , initiatrices de tumeurs ont été isolées à partir de tumeurs de patients primaire par le tri des cellules exprimant différents biomarqueurs du SCC (tels que la drogue efflux transporteurs expression 23, CD44 élevé, CD24 faible CD133 élevé, c-Met + phénotype 10,24, 25, ou ALDH haute activité 26) ou la culture de la tumeur primaire du patient pour former squamospheres qui ont des propriétés du SCC. Néanmoins, le nombre de squamospheres diminue considérablement après deux passages, donnant ainsi une petite taille de l' échantillon pour une caractérisation des études 27. Par conséquent, des essais in vitro à partir de lignées cellulaires bien établies est une solution plus facile à concevoir des expériences en vue d'améliorer la connaissance des CSC.
Le but de cet article est de proposer une méthode pour isoler CSCs de lignées de cellules HNSCC utilisant cytométrie de flux multiparamétrique analyse unnd tri cellulaire. L'expression de CD44 en corrélation avec plusieurs propriétés CCM y compris l'activité de ALDH, Side Population (SP) phénotype, la capacité de formation sphéroïde et tumorigénicité sont utilisés pour isoler et caractériser cette sous-population de CSCs. CD44 est une glycoprotéine de surface cellulaire, est impliquée dans l'adhésion cellulaire et la migration. CD44 est fortement exprimé dans de nombreuses tumeurs solides CSCs 28, y compris dans la tête et le cancer du col modèles 29-31. De plus, les cellules CD44 élevées peuvent générer in vivo d' une tumeur hétérogène alors que les cellules CD44 faibles ne peuvent pas 10. Le dosage de PS est basé sur le potentiel différentiel des cellules à efflux le colorant Hoechst 22 par l' intermédiaire de la famille ATP-binding cassette (ABC) , des protéines de transport surexprimés dans la membrane du SCC. Ce dosage comprend l'utilisation d'inhibiteurs de transporteurs ABC tels que le vérapamil dans les échantillons témoins. Aldéhyde déshydrogénase (ALDH) est une enzyme intracellulaire qui est impliqué dans la conversion du rétinol à retl' acide inoic lors de la différenciation des cellules souches début 25,26. Les cellules qui présentent une forte activité ALDH montrent le comportement des cellules souches comme dans HNSCC 26 et un très petit nombre de cellules élevées ALDH sont capables de générer des tumeurs in vivo 26,32.
La combinaison de ces marqueurs et des propriétés a été utilisé avec succès par Bertrand e t al. , Pour étudier la résistance in vitro et in vivo de ces cellules souches cancéreuses à un rayonnement de photons et 19 ions carbone. Leurs résultats ont clairement montré que la combinaison de différents marqueurs cellulaires et propriétés sont plus sélectifs pour les études utiles sur les populations HNSCC CCM que les approches mono-marqueurs.
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Protocol
Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives locales sur les soins aux animaux. Tous les détails de cette étude ont été approuvés par le CECCAPP, un comité d'éthique français.
1. La sélection d'une population latérale (SP) par le colorant Hoechst efflux Dosage
- Coloration 50 millions de cellules avec le colorant Hoechst 33342.
- Préparer deux 15 ml dans des tubes stériles à fond conique: un tube marqué "HOECHST" et une étiqueté «Hoechst et vérapamil». Préparer 10 ml de solution de chlorhydrate de vérapamil 5 mM dans de l'eau stérile. Préparer le milieu de culture (MC) pour les cellules souches.
- Pour préparer CM pour le SCC (CM-CSC), combiner les éléments suivants: Eagle modifié milieu de Dulbecco (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% de sérum de veau foetal (FCS), 0,04 mg / L d'hydrocortisone , 100 U / ml de pénicilline, 0,1 g / l de streptomycine et 20 ug / L de facteur de croissance épidermique (EGFR).
- Sous une hotte à flux laminaire, trypsiniser cellules. Retirez le support, laver avec sle phosphate de terile une solution saline tamponnée (PBS) et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA (0,5 g / L) pour un flacon de 75 cm. Incuber 3 min à 37 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant du milieu de culture utilisé pour la lignée cellulaire parentale. Compter le nombre de cellules en utilisant un compteur de cellules.
- Pour préparer CM lignée cellulaire parentale (CM-P), de compléter DMEM avec 10% de FCS, 0,4 mg / L d'hydrocortisone, 100 U / ml de pénicilline et 0,1 g / L de streptomycine).
- Diluer la suspension cellulaire obtenue à l'étape 1.1.2 pour obtenir 10 7 cellules / ml dans du CM-P. Divisez la suspension cellulaire dans les 2 tubes préparés: mettre 100 pi (10 6 cellules) dans le tube "Hoechst et vérapamil" et 4 ml (4 x 10 7 cellules) dans le tube "Hoechst".
- Dans l'échantillon "Hoechst et vérapamil", ajouter 10 pi de solution de chlorhydrate de 5 mM vérapamil (concentration finale: 0,5 mM) et mélanger doucement. Ajouter 5 ul de 1 g / L de solution de Hoechst (concentration finale: 0,1 g / l). Dans l'échantillon & #34; Hoechst ", ajouter 5 pl de 1 g / solution par 10 6 cellules (200 au total ul) L Hoechst Désormais, conserver les échantillons protégés contre l' exposition de la lumière directe en utilisant une feuille d'aluminium..
- Incuber tous les tubes dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 1 h 30 min. Mélanger doucement toutes les 15 min pour empêcher les cellules de s'installer.
- Tubes à centrifuger à 250 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot avec 2 ml de 1 x PBS.
- Tubes à centrifuger à 250 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. Resuspendre "Hoechst et le vérapamil" culot dans 500 pl de 5 mg / l d'iodure de propidium (PI) dilué dans du tampon PBS et le culot "HOECHST" dans 4 ml de 5 mg / L PI dilué dans du tampon PBS.
- Transfert solutions d'échantillon à travers un tamis de 70 um cellulaire pour éliminer les agrégats et de recueillir des cellules individuelles dans des tubes pour l'absorption de l'échantillon sur la cytométrie de flux. Conserver les échantillons sur la glace et la protection contre l'exposition de la lumière directe en utilisant une feuille d'aluminium.
- Préparer deux 15 ml dans des tubes stériles à fond conique: un tube marqué "HOECHST" et une étiqueté «Hoechst et vérapamil». Préparer 10 ml de solution de chlorhydrate de vérapamil 5 mM dans de l'eau stérile. Préparer le milieu de culture (MC) pour les cellules souches.
- jesolation de la population latérale Hors colorant Hoechst par Cell Sorting.
- Effectuer Hoechst séparation cellulaire négative sur une cytométrie en flux trieur avec les paramètres suivants: laser UV (355 nm), 2 détecteurs sur le chemin laser UV avec Hoechst bleu (450/50 BP) et rouge Hoechst (610/20 BP) filtres, et 2 collectionneurs.
- Tout d'abord, analyser l'échantillon "Hoechst" qui sert de contrôle positif pour la coloration et cytomètre de flux set-up.
- Utilisation du logiciel cytomètre, sur la fenêtre "Global Feuille", cliquez sur "Dot Plot" (cinquième top photo de droite) et de créer un graphique sur la feuille de calcul global. En ordonnée, avec un clic droit, sélectionnez FSC-A (diffusion vers l' avant) et sur l' abscisse, SSC-A (diffusion latérale) (figure 1A). De la même manière, créer un SSC-W par rapport SCC-H dot plot. Sur ce second tracé de points, pour créer une région de P1, cliquez sur "Polygon gate" (quatorzième top photo de droite) (figure 1B) 33.
Note: La région P1 seraenglober des cellules individuelles et discriminer doublets. - Facultatif: Exclure PI cellules positives en créant une FSC-A par rapport à PI fermée sur P1. Sur cette parcelle de point, sélectionnez la population négative PI (P2) pour exclure les cellules mortes positives PI.
- Utilisation du logiciel cytomètre, sur la fenêtre "Global Feuille", cliquez sur "Dot Plot" et créer un graphique sur la feuille de calcul global. En ordonnée, avec un clic droit, sélectionnez bleu Hoechst-A et abscisse, rouge Hoechst-A. Avec un clic droit sur la population, sélectionnez "Afficher la population» et P1. Sur cette parcelle de point, créer une région (P2) pour sélectionner les cellules négatives population du côté de colorant Hoechst (SP) qui apparaît comme un bras latéral sur la gauche de la principale population de cellules (figure 1C).
- Analyser l'échantillon "Hoechst" et de recueillir 10.000 événements. Pour veiller à ce que la porte P2, qui représente la population de SP, est bien placé, analyser l'échantillon "Hoechst et vérapamil" (10.000 événements)d'observer la disparition de la population de SP (figure 1D).
- Collecter les SP Hoechst colorant cellules négatives dans un tube de 15 ml contenant 1 ml de CM-CSC préparés 1.1.1.1.
- A la fin du tri cellulaire, centrifuger la suspension de cellules à 250 g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot avec 1 ml de CM-SCC. Compter le nombre de cellules triées en utilisant un compteur de cellules et de transférer un nombre approprié de cellules dans un flacon de culture (voir le tableau 1). Ajouter CM-CSC et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 atmosphère.
- Maintenir des cellules en culture dans les mêmes conditions pour un maximum de 2 passages jusqu'à ce qu'il y ait un minimum de 5 x 10 7 cellules (voir l' étape 3, "méthode de culture cellulaire»).
- Effectuer Hoechst séparation cellulaire négative sur une cytométrie en flux trieur avec les paramètres suivants: laser UV (355 nm), 2 détecteurs sur le chemin laser UV avec Hoechst bleu (450/50 BP) et rouge Hoechst (610/20 BP) filtres, et 2 collectionneurs.
2. Sélection de la haute / ALDH élevée Sous-population CD44 dans la population Side Classé
- Coloration 50 millions de cellules SP avec le kit de détection ALDH et CD44 Anticorps.
- Préparer sept tubes de 15 ml stériles étiquetés comme suit: «non marqué» (Tube a), "CD44-APC" (Tube b), "IgG1-APC" (Tube c), "ALDH" (Tube d), "ALDH et DEAB "(Tube e)," ALDH et CD44-APC "(Tube f)," ALDH, DEAB et CD44-APC "(Tube g). Conservez tous les tubes et réactifs à 4 ° C au cours de la coloration.
- Préparer un tampon A avec 4,5 ml de tampon 1 (contenue dans le kit) et 45 pi de CD44-APC (allophycocyanine) anticorps (dilution 1: 100). Préparer un tampon B avec 100 ul de tampon 1 et 1 pi d'anticorps IgG1-APC (dilution 1: 100). Préparer le tampon C avec 4 ml de tampon 1 et 20 ul du réactif de la trousse.
- Préparer une suspension cellulaire des cellules préalablement trié (étape 1.2.5) à 10 7 cellules / ml. Ajouter 100 pl (10 6 cellules) de la suspension cellulaire sur les tubes a, b et c et 4 ml (4 x 10 7 cellules) à tubes f. Pour le moment, ne pas mettre les cellules dans des tubes d, e et g.
- Centrifuger les tubes contenant les cellules à 250 xg pendant 5 min. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les pastilles dans des tubes a, b et c dans 100 ul de tampon 1. Ajouter 5 ul de diéthylaminobenzaldéhyde (DEAB), un inhibiteur de l'ALDH tubes e et g.
- Resuspendre les cellules dans le tube f avec 4 ml de réactif C et à transférer immédiatement 100 pl dans des tubes d, e et g. Incuber tous les tubes dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 min et protéger contre l'exposition de la lumière directe en utilisant une feuille d'aluminium. Mélanger la suspension cellulaire doucement par tourbillonnement au bout de 15 min pour empêcher les cellules de se fixer.
- A partir de ce moment, garder les tubes sur la glace et à l'abri de l'exposition de la lumière directe en utilisant une feuille d'aluminium. Centrifuger tous les tubes à 250 g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant.
- tube Resuspendre f dans 4 ml et tubes b et g avec 100 pi de tampon A. Tube Resuspendre c avec 100 pi de tampon B. Pour les autres tubes, ajouter 100 pi de tampon 1. Incuber 10 min à 4 °; C.
- Centrifuger tous les tubes à 250 g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant. Rincer une fois avec 1 ml de tampon 1 (4 ml pour le tube f) et centrifuger à nouveau à 250 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. Remettre en suspension le culot dans le tube f 4 ml et de tous les autres tubes dans 1 ml de tampon 1.
- Transférer les solutions d'échantillon à travers 70 crépines cellulaires um pour éliminer les agrégats et de recueillir des cellules individuelles dans des tubes appropriés pour l'absorption de l'échantillon sur cytométrie de flux.
- Isolement du CD44 haute / ALDH haute cellule Population par Fluorescence tri cellulaire activé.
- Effectuer CD44 haute / ALDH haute tri cellulaire sur une cytométrie en flux trieur avec les paramètres suivants: laser bleu (488 nm) et le laser rouge (633 nm), 1 détecteur sur le chemin de laser bleu avec un filtre FITC (530/30), 1 détecteur sur le trajet du laser rouge avec un filtre d'APC (660/20) et 2 collecteurs.
- Utilisation du logiciel cytomètre, cliquez sur "Dot Plo(Le cinquième top photo de droite) t "pour créer une FSC-A par rapport SSC-A tracé de points tel que décrit dans la section 1.2.1.2, pour vérifier la morphologie des cellules et sélectionner une population composée de cellules individuelles avec un SSC-W par rapport SSC-H dot plot.
- Utilisation du logiciel cytomètre, sur la fenêtre "Global Feuille", cliquez sur "Dot Plot" et créer un graphique sur la feuille de calcul global. En ordonnée, avec un clic droit, sélectionnez APC-A et abscisse, FITC-A afin de sélectionner la population à double teinté. Créer une porte en utilisant des tubes d et e pour sélectionner des cellules haute ALDH (Figure 2A). Nota: Les cellules positives disparaissent dans le tube électronique traité avec DEAB (figure 2B).
- Sur le même graphique, créer une deuxième porte en utilisant des tubes b et c afin de sélectionner les cellules CD44 élevées (Figure 2C et 2D). Les cellules positives disparaissent dans le tube contenant IgG1-APC. Analyser tubes f et g et créer une troisième porte qui comprend CD44 haute / ALDH <sup> cellules élevées (Figure 2E et 2F).
Remarque: si des cellules positives sont présentes dans le tube contenant IgG1-APC (figure 2D), l'interaction entre les cellules et l'anticorps APC colorées ne sont pas spécifiques.
- Sur le même graphique, créer une deuxième porte en utilisant des tubes b et c afin de sélectionner les cellules CD44 élevées (Figure 2C et 2D). Les cellules positives disparaissent dans le tube contenant IgG1-APC. Analyser tubes f et g et créer une troisième porte qui comprend CD44 haute / ALDH <sup> cellules élevées (Figure 2E et 2F).
- Collecter CD44 haute / ALDH cellules élevées dans un tube de 15 ml contenant 1 ml de CM-CSC. Collecter aussi CD44 bas / ALDH bas dans un tube de 15 ml contenant 1 ml de CM 19. Note: Préparer CM-CSC comme décrit à l'étape 1.1.1.1.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 250 g pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre le culot avec 1 ml de CM-CSC. Comptez le nombre de cellules triées.
3. Cellule Méthode Culture
- Après le double-tri des cellules telles que décrites ci - dessus, la plaque les cellules triées dans un flacon de culture approprié (tableau 1) avec CM-CSC à 37 ° C avec 5% de CO 2. Après 18-24 heures,vérifier si les cellules ont adhéré et changer le milieu de culture. Changer le milieu de culture tous les 3 jours jusqu'à ce que les colonies d'expansion est supérieur à 50% confluentes.
- Utiliser le volume approprié de trypsine 0,5 g / l - de l' EDTA (tableau 1) pour trypsiniser cellules du flacon de culture. Incuber les cellules 3 à 5 min à 37 ° C. Ajouter le volume approprié de CM-CSC (Tableau 1) pour arrêter l'action de la trypsine.
- Comptez le nombre de cellules obtenues et la plaque 4 x 10 5 cellules dans un flacon de culture de 175 cm² avec CM-CSC. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. A cette concentration, les cellules avec un temps de doublement de 24 h seront 70% confluentes en 7 jours.
- Utilisez CSCs pour in vitro ou des expériences in vivo avant d'avoir subi 3 passages.
4. Confirmation de la tumeur potentielle et SCC Caractéristiques
- Tumor Formation Sphère à confirmer le potentiel de tumeur de la CD44 haute / ALDHLes cellules élevées.
- Trypsiniser cellules comme décrit dans 3.2. Ajouter 1 x 10 6 cellules à un tube de 15 ml et on centrifuge à 250 g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans un DMEM: F12 (3: 1) FCS milieu sans, 20 ng / ml de rhEGF, 4 mg / L de l'héparine et 1x B27. Incuber les cellules dans un puits 6 de faible plaques d' ancrage de flacon de culture à 37 ° C et 5% de CO 2.
Remarque: Utilisez DMEM: F12 (3: 1) contenant 5% de FCS, 20 ng / ml de rhEGF, 4 mg / L de l'héparine et 1x B27 si la cellule ne se développe pas sans FCS. - Observer la formation de la sphère de la tumeur à l' aide d' un microscope optique à partir de 4 à 10 jours après le semis (figure 3A).
Remarque: le diamètre de la sphère de la tumeur doit être supérieure à 35 um. Cellules CD44 haute / ALDH élevées vont montrer une tumeur formation plus rapide et plus intense de la sphère en termes de nombre et de la taille par rapport à CD44 faible / ALDH faible.
- Trypsiniser cellules comme décrit dans 3.2. Ajouter 1 x 10 6 cellules à un tube de 15 ml et on centrifuge à 250 g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans un DMEM: F12 (3: 1) FCS milieu sans, 20 ng / ml de rhEGF, 4 mg / L de l'héparine et 1x B27. Incuber les cellules dans un puits 6 de faible plaques d' ancrage de flacon de culture à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Évaluation de In Vivo tumorigénicité AprèsInjection sous - cutanée de CD44 élevé ALDH élevées cellules / NOD-SCID Souris.
- Après le tri, remettre en suspension les cellules dans du PBS à trois concentrations différentes (10 4 cellules / ml, 10 5 cellules / ml, et 10 6 cellules / ml). Injecter sous - cutanée de 100 ul de 10 4 cellules / ml (10 3 cellules) dans la région du flanc droit de 6 souris. Faites de même pour 10 5 cellules / ml (10 4 cellules), et 10 6 cellules / ml (10 5 cellules).
Note: dilution inférieure à 10 3 cellules peuvent être testées. - Injecter la même concentration de cellules CD44 ALDH bas / bas dans la région du flanc gauche. Moniteur injecté des souris pour un maximum de 10 semaines pour voir la progression tumorale 19.
- Après le tri, remettre en suspension les cellules dans du PBS à trois concentrations différentes (10 4 cellules / ml, 10 5 cellules / ml, et 10 6 cellules / ml). Injecter sous - cutanée de 100 ul de 10 4 cellules / ml (10 3 cellules) dans la région du flanc droit de 6 souris. Faites de même pour 10 5 cellules / ml (10 4 cellules), et 10 6 cellules / ml (10 5 cellules).
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Representative Results
L'isolement des CSCs de lignées de cellules HNSCC requis deux tris successifs en raison de la très faible pourcentage de CSCs dans la lignée cellulaire parentale. Le premier tri est basé sur la capacité des cellules souches cancéreuses à exclure le colorant Hoechst du fait de transporteurs à efflux. Cela a abouti à l' acquisition de 1-5% de la population totale des cellules triées (figure 1). Au cours du colorant Hoechst cellulaire négative tri, vérifier la taille et la granulation des cellules triées en regardant le FSC-A par rapport au SSC-A tracé de points (figure 1A). Ensuite, discriminer doublets et des fragments de cellules en utilisant le SSC-W par rapport SSC-H tracé de points et la sélection de la population P1 (figure 1B). Sur cette population P1, créer un Hoechst Red-A contre Hoechst Blue-Un terrain dot. Avec le tube marqué "HOECHST", le SP apparaît sous la forme d' un bras latéral à gauche de la principale population de cellules (figure 1C). Cette population doit disparaître quand ils are traité avec le vérapamil (figure 1D), un inhibiteur des transporteurs ABC. La coloration de PI permet l'exclusion des cellules mortes PI-positive , car cette population est sous-échelle sur le Hoechst Red-A l' échelle (figure 1C et 1D, ellipses bleues).
Le second tri cellulaire était basé sur l'expression élevée du récepteur et une grande activité de l' enzyme ALDH CD44 qui a permis l'acquisition de 0,5 à 2% par rapport aux cellules SP préalablement trié (figure 2). Avant le tri, différents contrôles ont été utilisés. Les premiers sont les «ALDH» et les «ALDH + DEAB" tubes nécessaires afin de placer la première porte sur les cellules hautes FITC (Figures 2A et 2B): cellules élevées ALDH ont été bloqués sur le FITC-A par rapport à APC-Un point terrain en utilisant le "ALDH" tube (figure 2A). La bonne position de la porte a été vérifiée à l'aide du «ALDH + DEAB "tube:.. DEAB inhibe ALDH, les cellules positives doivent disparaître de la porte (figure 2B) Si elles ne, modifier les conditions de la réaction (en augmentant la quantité de DEAB par exemple) Le second contrôle est le" CD44-APC "et les" tubes IgG1-APC "qui a permis de positionner la seconde porte sur les cellules élevées APC (figures 2C et 2D) en utilisant les cellules colorées avec l'anticorps CD44-APC (figure 2C). Cette population doit disparaître avec le tube de commande qui contient des cellules lgG1 APC (Figure 2D). dans le cas contraire, la liaison avec l'anticorps ne soit pas spécifique et de la BSA 0,5% doit être ajouté dans le tampon 1 de la trousse de détection de l' ALDH lors de la réaction d'anticorps. Enfin, la troisième le contrôle porte sur la "ALDH et CD44-APC" tube et "ALDH, DEAB et CD44-APC" tubes (figures 2E, 2F, 2G et 2H). la double staining ALDH Tube / CD44 est utilisé pour positionner la dernière porte sur les cellules doubles positives (Figure 2F) et le même tube traité avec DEAB est un contrôle pour vérifier que les cellules hautes ALDH disparaissent (figure 2F).
Ce protocole est utilisé pour trier CSCs du SQ20B et les lignées de cellules FaDu. Lorsque le tri est effectué pour la première fois sur une nouvelle lignée cellulaire, afin de s'assurer que les cellules triées ont des cellules souches analogues à des propriétés, il est nécessaire de confirmer leur potentiel de tumeur. L' une des propriétés de cellules souches comme est sa capacité à former tumorspheres in vitro dans un milieu exempt de FSC. Sous cette condition, les cellules seulement le cancer souches ressemblant peuvent survivre et proliférer (figure 3A). En outre, des expériences de qPCR montrent une forte expression de β-caténine (marqueur de la caractéristique de tige) dans CD44 ALDH cellules haute / haute (figure 3B), ainsi que Bmi-1 et Notch 19 </ Sup>. Enfin, CD44 des cellules haute haute / ALDH sont également capables de former des tumeurs lorsqu'elles sont injectées en faibles quantités par rapport à CD44 ALDH faibles cellules / bas 19.
Figure 1: Isolement d'une population latérale excluant le colorant Hoechst (A) FSC-A par rapport au SSC-A tracé de points.. (B) SSC-W par rapport SSC-H dot plot. (C, D) Hoechst Red-A contre Hoechst Blue-A tracé de points en utilisant le tube "Hoechst" (C) ou avec le tube "Hoechst et vérapamil" (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Donc , rter de CD44 haute ALDH cellules / élevées de cellules Hoechst tinctoriales négatives. FITC-A par rapport à APC-A tracé de points en utilisant le tube "ALDH" (A), le "ALDH + DEAB" tube (B), le "CD44-APC" le tube (C), le tube "IgG1-APC» (D), le "ALDH et CD44-APC" tube (E et G) ou le tube "ALDH DEAB et CD44-APC" (F et H). Les figures A, B, C, D, E et F ont été obtenus en utilisant la lignée cellulaire SQ20B. Figures G et H obtenus en utilisant la lignée cellulaire FaDu. Le vert indique CD44 faible / ALDH faibles cellules (Q3); bleu foncé indique CD44 bas / ALDH cellules élevées (Q1); pourpre indique CD44 haute / basse ALDH cellules (Q4); bleu clair indique CD44 haute / ALDH cellules haute (Q2)._upload / 53958 / 53958fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Confirmation du potentiel de la tumeur des cellules CD44 haute / ALDH élevées cellules CD44 Ordre haute / ALDH élevés ont pu former tumorspheres in vitro (A) dans un milieu pauvre-FCS. Barre d'échelle, 25 um. En outre, CD44 haute / ALDH haute surexpriment β-caténine, un marqueur de tumorigénicité (B). Cette quantification a été effectuée par qPCR et les barres d'erreur représentent SD. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Nombre de cellulestrié | Culture type de flacon | Volume Trypsine (ml) | Milieu de culture Volume (ml) |
| 10,000-200,000 | 1 puits d'une plaque à 6 puits ou une boîte de Pétri cm 3.5 | 0,5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | 1 T25 flacon de culture | 1 | 4 |
| > 1.000.000 | 1 flacon de culture T75 | 2 | dix |
Tableau 1: Culture type de flacon à utiliser en fonction du nombre de cellules triées Détails de la taille du flacon de culture pour le nombre approximatif de cellules triées sont donnés.. Le volume de la trypsine et le volume du milieu nécessaire pour le type de flacon de culture sont également fournis.
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode fiable pour l'isolement réussi de cellules souches cancéreuses à partir d'une lignée cellulaire spécifique qui est applicable à d'autres lignées de cellules HNSCC. Tête et du cou CSCs isolés sont ensuite appropriés pour une caractérisation moléculaire in vitro et la validation fonctionnelle par la transplantation chez des souris immunodéficientes 19. Cependant, certaines modifications peuvent être testés en fonction de la population de côté ou les CD44 haute / ALDH pourcentages élevés présents dans la lignée cellulaire parentale. Par exemple, si le pourcentage de cellules dans la population latérale est trop faible dans une lignée cellulaire particulière, la haute ALDH haute tri / CD44 peut être effectuée directement. Les marqueurs utilisés dans cette étude peuvent être remplacés par d' autres marqueurs appropriés pour la lignée cellulaire étudiés tels que CD133 haute 34 ou CD10 élevé 35.
Ce protocole repose sur deux tries de cellules. Trois couleurs de tri avec SP + CD44 + ALDH était pas possible avec les lignées cellulaires testées. D' abord, les lignées cellulaires parentales testées ici présentent moins de 5% de SP et de moins de 10% des cellules CD44 élevées haut / ALDH dans le PS. Par conséquent, SP / CD44 haute / ALDH représentent élevé de moins de 0,5% de la lignée cellulaire parentale. Par conséquent, un premier tri de SP est nécessaire afin d'enrichir la population en CD44 des cellules élevées élevées et / ou ALDH. Deuxièmement, pour trier 1% de la lignée cellulaire parentale, il faut 5 heures pour obtenir environ 300 000 cellules. Par conséquent, si une cellule de tri 3 couleurs est effectuée, la quantité de cellules recueillies sera très faible. En outre, plus le tri est déconseillée car elle peut affecter la viabilité des cellules.
En raison de la sélectivité de ce protocole d'isolement, la principale limitation est le petit nombre de CSCs obtenus. Cela pourrait être problématique pour effectuer d'autres expériences, car il est recommandé de ne pas les utiliser après 3 passages à cause de la perte rapide de CD44 et Ades marqueurs de la LDH. En outre, avant chaque nouvelle expérience, le pourcentage de CD44 des cellules haute haute / ALDH encore présents dans la suspension cellulaire doit être testé afin de vérifier le nombre de CSC qui a différenciées.
Il est impératif de préparer une solution de chlorhydrate de vérapamil et le milieu de culture contenant EGF juste avant l'utilisation que ces molécules sont très instables. Une solution mère de l'EGF à 20 mg / L est stable pendant trois mois à -20 ° C. Les variations du protocole Hoechst existent, mais la concentration finale de colorant utilisée est de 5 ug / ml. En outre, au cours du premier tri, les compositions des milieux de culture différentes doivent être testés en fonction de la lignée cellulaire utilisée. Une fois que les conditions de tri sont validées, il est nécessaire de vérifier les propriétés de la population de cellules triées en utilisant les différentes méthodes (section 4).
marqueurs de surface cellulaire, l'activité de ALDH et sa capacité à efflux colorants vitaux ont déjà été utilisés individually dans la littérature pour isoler CSCs de CETC. Cependant, le protocole décrit ici a l'avantage unique d'utiliser des combinaisons de différents marqueurs afin d'obtenir une spécificité élevée dans CSCs isolement à partir des lignées de cellules HNSCC. En outre, le CD44 tri pourrait être réalisée avec un anticorps anti-CD44 conjugué à des microbilles magnétiques et triées avec une colonne magnétique 36, mais cette méthode est applicable uniquement aux marqueurs de surface cellulaire et ne peut pas être utilisée pour un tri ALDH, empêchant double tri . Une autre méthode utilisée pour obtenir CSCs est la culture de tumorsphere de tumeurs primaires 37 ou 38 xénogreffes. Cependant, l'acquisition de ces tumeurs primaires ou xénogreffes sont associés à des contraintes éthiques.
Puisque cette méthode isole CSCs de HNSCC viables, ils peuvent être utilisés (après vérification de leur tumorigénicité) dans un certain nombre d'expériences qui mesurent la fonction physiologique de ces cellules. Il permet donc l'évaluation du comportementde CSCs suivant différentes approches thérapeutiques (radiothérapie, chimiothérapie). Il permet également à l'étude de divers paramètres biologiques tels que la migration / invasion, réparation de l' ADN, la signalisation cellulaire, etc. Par conséquent, l'obtention d'CSCs de différentes lignées cellulaires est un choix attrayant pour enquêter sur CCM propriétés.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
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