التحقيق في وظيفة من Coronin (أ) في المجاعة الاستجابة المبكرة لل<em> Dictyostelium discoideum</em> من جانب تجميع فحوصات
Summary
The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.
Abstract
تم العثور على Dictyostelium discoideum الاميبا في التربة وتتغذى على البكتيريا. عندما تصبح المصادر الغذائية الشحيحة، لأنها تفرز عوامل لبدء برنامج تنمية متعددة الخلايا خلالها الخلايا وحيدة chemotax نحو مراكز التجميع 1-4. هذه العملية تعتمد على إطلاق سراح الأدينوزين الأدينوزين الحلقي (المخيم) 5. وينتج المخيم في موجات من خلال اتخاذ إجراءات متضافرة من محلقة محلقة وphosphodiesterases، ويربط G البروتين يقترن مستقبلات المخيم 6،7. وفحص تستخدم على نطاق واسع لتحليل الآليات التي تشارك في دورة التنموية للانخفاض حقيقي النواة Dictyostelium discoideum يقوم على الملاحظة من تجميع الخلايا في ظروف المغمورة 8،9. يصف هذا البروتوكول تحليل دور coronin (أ) في دورة التنموية جوعا في لوحات زراعة الأنسجة مغمورة في محلول ملحي متوازن (BSS) 10. Coronin (أ) هو عضو في العلاقات العامة المحفوظة على نطاق واسععائلة otein من coronins التي تورطت في مجموعة واسعة من الأنشطة 11،12 الخلايا Dictyostelium تفتقر coronin وغير قادرة على تشكيل مجاميع متعددة الخلايا، ويمكن إنقاذ هذا العيب من خلال تزويد البقول من المخيم، مما يوحي بأن coronin وأعمال المنبع لل تتالي المخيم 10. التقنيات الموضحة في هذه الدراسات توفر أدوات قوية لتحقيق وظائف البروتينات خلال المراحل الأولى من دورة التنموية للDictyostelium discoideum المنبع من سلسلة المخيم. لذلك، وذلك باستخدام هذا التجميع الفحص قد تسمح للمزيد من الدراسة coronin وظيفة وتعميق فهمنا للبيولوجيا coronin.
Introduction
الأسرة coronin من البروتينات وحفظها للغاية في جميع أنحاء حقيقيات النوى. وتتميز هذه البروتينات عن طريق وجود الأمينية محطة التربتوفان اسبارتاتي (WD) تكرار المحتوية على المنطقة تليها منطقة فريدة من نوعها متصلة مجال ملفوف لفائف-كربوكسي محطة 13،14 (الشكل 1). قد تورطت Coronins في مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية، بما في ذلك تنظيم هيكل الخلية ونقل الإشارة 12. في الثدييات، وتصل إلى ستة جزيئات قصيرة coronin (coronin 1-6)، فضلا عن "جنبا إلى جنب" coronin 7، يمكن أن يشترك في اعرب 12،15. Coronin 1 هو فرد من أفراد الأسرة الأكثر دراسة على نطاق واسع، وتبين أن تشارك في تدمير مسببات المرض، T بقاء الخلية والإشارات العصبية. كيف، بالضبط، coronin 1 تنفذ هذه الأنشطة لا تزال غير واضحة. في حين coronin 1 وقد تبين لتنظيم الكالسيوم 2+ إشارة، التي تعتمد على المخيم وكذلك F-الأكتين الهيكل الخلوي تعديل 16-18، وشارك محتملجعلت -expression تصل إلى 7 أفراد الأسرة في الثدييات صعوبة في دراسة وظيفة الجزيئية للcoronins في هذه الأنظمة، وذلك بسبب التكرار المحتملة. على عكس الكائنات الثديية، وانخفاض discoideum حقيقي النواة Dictyostelium يعبر عن اثنين فقط من أعضاء coronin الأسرة (coronin ألف، ortholog من الثدييات coronin 1 و coronin باء، ortholog من coronin الثدييات 7) مع وظائف على ما يبدو غير زائدة 15،19،20. هذه الحقيقة تجعل Dictyostelium discoideum نموذجا قويا لدراسة وظيفة coronins.
لدراسة دور coronin وفي Dictyostelium discoideum، نحن الناجم عن دورة التنموية جوعا في لوحات زراعة الأنسجة التي تحتوي على عازلة متوازن محلول الملح (BSS) باستخدام خلايا نوع البرية أو الخلايا التي تفتقر إلى coronin و10. لقد وجدنا أن الخلايا التي تفتقر إلى coronin وكانت غير قادرة على تشكيل مجاميع متعددة الخلايا على الموت جوعا. للحصول على التقييم الكمي الدقيق لهذا النمط الظاهري للالآلية تصوير الخلايا الحية وصفها في هذا البروتوكول هو أداة حيوية. الخلل في الشروع في الاستجابة للجوع في وقت مبكر في الخلايا التي تفتقر إلى coronin ويمكن إنقاذهم عن طريق توفير نبضات من المخيم، مما يوحي بأن coronin وأعمال المنبع من سلسلة المخيم. وقد استخدم تطبيق خارجي من البقول المخيم لمحاكاة بدء التنمية من خلال عدة مختبرات في 8،9 الماضي. ومع ذلك، ويعرف هذا الإجراء أيضا أن تعتمد إلى حد كبير على كثافة الخلايا وتوقيت. ولذلك، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يهدف للحد من هذه المتغيرات وذلك لضمان درجة عالية من التكاثر. معا، والتقنيات المستخدمة في هذه الدراسات توفر أدوات قوية لتحقيق وظائف البروتينات خلال المراحل المبكرة من دورة التنموية للDictyostelium discoideum ولديها القدرة على تحديد حتى- وكذلك المؤثرات المصب coronin وظيفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتوجد البروتينات coronin في معظم الأنواع من كليد حقيقية النواة. Dictyostelium discoideum coronin A، ونديد من coronin الثدييات 1، ويشارك في الاستجابة للجوع في وقت مبكر، منذ coronin A-نقص الخلايا ليست قادرة على تشكيل مراكز التجميع خلال وقت مبكر التنموية دورة 10. لتكون قادرة على كميا وبد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Dictyostelium Stock Center for strains and reagents. This study was financed by grants from the Swiss National Science Foundation and the Canton of Basel.
Materials
| HL-5 media (for 1L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4∗2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4∗2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
References
- Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
- Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
- Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
- Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
- Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
- Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
- Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
- Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
- Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
- Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268 (2011).
- Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
- Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
- Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
- Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820 (2014).
- Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
- Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
- de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
- Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
- Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
- Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
- Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
- Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
- Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).
