Erken Açlık Tepki Koronin A Fonksiyonu incelenmesi<em> Dictyostelium discoideum</em> Toplama Tahliller
Summary
The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.
Abstract
Dictyostelium discoideum amiplerin beslenen toprak bulunur. Besin kaynakları kıt hale geldiğinde, tek hücre toplama merkezlerine 1-4 doğru chemotax sırasında bir çok hücreli geliştirme programını başlatmak için faktörleri salgılar. Bu işlem, siklik adenozin monofosfat (cAMP) 5 serbest bağlıdır. cAMP adenilat siklaz ve fosfodiesterazlarm birlikte hareket dalgasından üretilen ve G protein-eşli reseptör cAMP 6,7 ile bağlanır. Yaygın olarak kullanılan deney, daldırılmış koşullar 8,9 hücre toplanmasının gözlemine dayanır Alt düzey ökaryot Dictyostelium discoideum gelişimsel döngüsünde yer alan mekanizmaların analiz etmek. Bu protokol, dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) 10 içine daldırılmış doku kültürü plakaları içinde açlık gelişim döngüsünde Koronin A rolünün analizine açıklanmaktadır. Koronin bir yaygın korunmuş pr üyesidirfaaliyetleri 11,12 çeşitli suçlanmıştır coronins bir otein ailesi. A Koronin eksik Dictyostelium hücreleri çok hücreli agrega oluşturamamaktadırlar ve bu kusur düşündüren, cAMP bakliyat tedarik tarafından kurtarıldı olabilir üst baş eylemleri Koronin cAMP 10 basamakla. Bu çalışmalarda tarif edilen teknikler cAMP kaskadının yukan Dictyostelium discoideum gelişimsel döngüsünün ilk aşamalarında proteinlerin işlevleri araştırmak için güçlü araçlar sağlar. Bu nedenle, bu toplama tahlil kullanan bir fonksiyon Koronin ve daha fazla çalışma izin ve Koronin biyoloji anlayışımızı ilerleyebilir.
Introduction
Proteinlerin Koronin aile çok ökaryotlarda boyunca muhafaza edilir. Bu proteinler, bir amino-terminali triptofan-aspartat (WD) tekrar-ihtiva eden bir karboksi-terminal halkalaştırılmış halka etki 13,14 bağlı eşsiz bir bölgesi takip bölge (Şekil 1) bulunması ile karakterize edilir. Coronins iskelet düzenlemesi ve sinyal iletimi 12 de dahil olmak üzere hücresel fonksiyonların çeşitli implike edilmiştir. Memelilerde, altı adede kadar kısa Koronin molekülleri (Koronin 1-6) ve 7 Koronin bir tandem, 12,15 birlikte ifade edilebilir. Koronin 1 üzerinde en çok çalışılan aile üyesi ve patojen yok, T hücre hayatta kalma ve nöronal sinyal dahil olduğu gösterilmiştir. Nasıl, tam, Koronin 1 bu faaliyetleri yürütmektedir belirsizliğini koruyor. 1 Koronin Ca 2+ ve cAMP bağımlı sinyal yanı sıra F-aktin olarak hücre iskeleti modülasyonu 16-18, potansiyel işbirliği düzenleyen gösterilmiştir ikenMemelilerde kadar 7 aile üyelerinin -Anlatım zorlu nedeniyle potansiyel işten çıkarmalara, bu sistemlerdeki coronins moleküler fonksiyonunu incelemek için yapmıştır. Memeli organizmalardan farklı, alt ökaryot Diktiyostelyum diskodeyum görünüşte olmayan gereksiz fonksiyonları 15,19,20 ile sadece iki Koronin aile üyelerini (Koronin A, memeli Koronin 1 ve Koronin B ortologunu, memeli Koronin 7 ortologu) ifade eder. Bu durum, Dictyostelium discoideum coronins fonksiyonu çalışma güçlü bir model haline getirir.
Dictyostelium discoideum'da Koronin A'nın rolünü incelemek için, 10 Koronin barındırmayan vahşi tipli hücreler veya hücre kullanılarak dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) tampon içeren doku kültürü plakaları içinde açlık gelişim döngüsü neden olmuştur. Biz Koronin A eksik hücreler açlık üzerine çok hücreli agrega oluşturmak mümkün olduğunu bulmuşlardır. Bu fenotip doğru kantitatif bir değerlendirme içinBu protokol açıklanan otomatik canlı hücre görüntüleme önemli bir araçtır. Bir Koronin eksik hücrelerin erken açlık tepkisinin başlamasında kusur cAMP çağlayan yukarı bir eylemleri Koronin düşündüren, cAMP bakliyat tedarik tarafından kurtarıldı edilebilir. Gelişiminin başlaması simüle etmek için, cAMP darbelerinin egzojen uygulaması son 8,9 çeşitli laboratuarlar tarafından kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu prosedür, aynı zamanda, hücre yoğunlukları ve zamanlaması büyük ölçüde bağlı olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, burada açıklanan protokol tekrarlanabilirliği yüksek derecede garanti altına almak için, bu bir değişkenliğe azaltmayı amaçlamaktadır. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalarda kullanılan teknikler Dictyostelium discoideum gelişimsel döngüsünün erken evrelerinde proteinlerin işlevleri araştırmak için güçlü araçlar sağlar ve yukarı tespit hem de bir işlevi Koronin aşağı doğru efektör potansiyeline sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Koronin proteinler ökaryotik dalının en takson bulunurlar. Dictyostelium discoideum Koronin bir memeli Koronin 1 homologu hücreler erken gelişim sırasında çekiş merkezleri oluşturmak mümkün değildir bir eksikliği Koronin yana erken açlık yanıt olarak katılır döngüsü 10. nicel ve doğru bir suşları arasında gelişiminde gecikme değerlendirmek mümkün, otomatik sahne denetleyicisi ile bir mikroskop canlı hücre görüntüleme set-up önemli bir araçtır.
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Dictyostelium Stock Center for strains and reagents. This study was financed by grants from the Swiss National Science Foundation and the Canton of Basel.
Materials
| HL-5 media (for 1L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4∗2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4∗2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
References
- Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
- Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
- Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
- Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
- Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
- Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
- Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
- Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
- Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
- Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268 (2011).
- Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
- Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
- Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
- Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820 (2014).
- Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
- Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
- de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
- Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
- Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
- Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
- Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
- Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
- Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).
