Indagare la funzione di Coronin A nel precoce fame di risposta<em> Discoideum Dictyostelium</em> Per aggregazione Dosaggi
Summary
The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.
Abstract
Dictyostelium discoideum un'ameba si trovano nel terreno, si nutrono di batteri. Quando fonti di cibo diventano scarse, secernono fattori di avviare un programma di sviluppo multicellulare, durante il quale le singole cellule chemiotassi verso i centri di aggregazione 1-4. Questo processo dipende dal rilascio di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) 5. cAMP è prodotto in onde attraverso l'azione concertata di ciclasi e fosfodiesterasi, e si lega al G recettori accoppiati alla proteina cAMP 6,7. Un test ampiamente utilizzato per analizzare i meccanismi coinvolti nel ciclo di sviluppo del eucariote Dictyostelium discoideum inferiore si basa sull'osservazione di aggregazione delle cellule in condizioni sommerse 8,9. Questo protocollo descrive l'analisi del ruolo di Coronin A nel ciclo di sviluppo per fame in piastre tessuto-coltura sommersa in soluzione salina bilanciata (BSS) 10. Coronin A è un membro del pr ampiamente conservatafamiglia otein di coronins che sono stati implicati in una vasta gamma di attività 11,12. Dictyostelium cellule prive Coronin A sono in grado di formare aggregati multicellulari, e questo difetto può essere salvato fornendo impulsi di cAMP, suggerendo che Coronin A agisce a monte della cAMP cascata 10. Le tecniche descritte in questi studi forniscono strumenti robusti per indagare funzioni delle proteine durante le fasi iniziali del ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum monte della cascata cAMP. Pertanto, utilizzando questo test aggregazione può consentire l'ulteriore studio della Coronin Una funzione e far progredire la nostra comprensione della biologia Coronin.
Introduction
La famiglia Coronin delle proteine è altamente conservata in tutta eucarioti. Queste proteine sono caratterizzati dalla presenza di un triptofano-aspartato amino-terminale (WD) ripetere contenente regione seguita da una regione unica collegata a un dominio coiled-coil carbossi-terminale 13,14 (figura 1). Coronins sono stati implicati in una varietà di funzioni cellulari, tra cui la regolamentazione del citoscheletro e trasduzione del segnale 12. Nei mammiferi, fino a sei brevi molecole Coronin (Coronin 1-6) e un 'tandem' Coronin 7, possono essere co-espressi 12,15. Coronin 1 è il membro della famiglia più ampiamente studiato, e ha dimostrato di essere coinvolto in distruzione degli agenti patogeni, la sopravvivenza delle cellule T e la segnalazione neuronale. Come, esattamente, Coronin 1 svolge tali attività rimane poco chiaro. Mentre Coronin 1 è stato mostrato per regolare Ca 2+ e cAMP-dipendente di segnalazione così come F-actina citoscheletro modulazione 16-18, il potenziale co-expression di un massimo di 7 membri della famiglia nei mammiferi ha reso difficile per studiare la funzione molecolare di coronins in questi sistemi, a causa di potenziali esuberi. A differenza di organismi dei mammiferi, il più basso eucariote Dictyostelium discoideum esprime solo due membri della famiglia Coronin (Coronin A, la ortologo di mammiferi Coronin 1 e Coronin B, la ortologo di Coronin mammiferi 7) con funzioni apparentemente non ridondanti 15,19,20. Questo fatto rende Dictyostelium discoideum un modello potente per studiare la funzione di coronins.
Per studiare il ruolo di Coronin A in Dictyostelium discoideum, abbiamo indotto il ciclo di sviluppo per fame in piastre di coltura tissutale contenente tampone equilibrata soluzione salina (BSS) utilizzando sia le cellule di tipo selvatico o cellule prive Coronin A 10. Abbiamo scoperto che le cellule prive Coronin A erano in grado di formare aggregati multicellulari su fame. Per una valutazione quantitativa accurata di questa fenotipol'imaging cellulare dal vivo automatizzato descritto in questo protocollo è uno strumento di vitale importanza. Il difetto nella inizio della risposta di inedia nelle prime cellule mancanti Coronin A può essere salvato fornendo impulsi di cAMP, suggerendo che Coronin A agisce a monte della cascata cAMP. L'applicazione esogena di impulsi cAMP per simulare l'apertura di sviluppo è stato utilizzato da diversi laboratori in passato 8,9. Tuttavia, questa procedura è anche noto per essere fortemente dipendente densità cellulari e temporizzazione. Pertanto, il protocollo qui descritto mira a ridurre questi variabilità per garantire un elevato grado di riproducibilità. Nel loro insieme, le tecniche utilizzate in questi studi forniscono strumenti robusti per indagare funzioni delle proteine durante le prime fasi del ciclo di sviluppo di Dictyostelium discoideum e hanno il potenziale per identificare a monte così come effettori a valle di Coronin Una funzione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le proteine Coronin si trovano nella maggior parte dei taxa del clade eucariotica. Dictyostelium discoideum Coronin A, l'omologo di Coronin mammiferi 1, è coinvolto nella risposta di inedia in anticipo, dal momento che Coronin Un deficit di cellule non sono in grado di formare centri di aggregazione durante l'inizio dello sviluppo ciclo 10. Per essere in grado di valutare quantitativamente e con precisione il ritardo di sviluppo tra i ceppi, un set-up microscopio imaging cellulare dal …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Dictyostelium Stock Center for strains and reagents. This study was financed by grants from the Swiss National Science Foundation and the Canton of Basel.
Materials
| HL-5 media (for 1L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4∗2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4∗2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
References
- Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
- Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
- Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
- Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
- Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
- Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
- Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
- Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
- Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
- Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268 (2011).
- Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
- Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
- Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
- Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820 (2014).
- Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
- Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
- de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
- Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
- Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
- Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
- Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
- Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
- Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).
