Undersöker funktion Coronin A i tidig Svält svar av<em> Dictyostelium discoideum</em> Genom aggregering Analyser
Summary
The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.
Abstract
Dictyostelium discoideum amöba finns i jord, livnär sig på bakterier. När matkällor blir knappa, de utsöndrar faktorer att inleda en flercellig utvecklingsprogram, under vilken enskilda celler chemotax mot aggregering centra 1-4. Denna process är beroende på frisättningen av cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) 5. cAMP produceras i vågor genom samordnade åtgärder av adenylatcyklas och fosfodiesteraser, och binder till G-proteinkopplade receptorer cAMP 6,7. En allmänt använd analys för att analysera de mekanismer som är involverade i utvecklingscykeln för lägre eukaryot Dictyostelium discoideum baseras på observation av cell aggregation i submersa betingelser 8,9. Detta protokoll beskriver analys av den roll coronin A i utvecklingscykeln av svält i vävnadsodlingsplattor nedsänkta i balanserad saltlösning (BSS) 10. Coronin A är en medlem av den allmänt bevarade protein familj av coronins som har implicerats i ett stort antal olika aktiviteter 11,12. Dictyostelium celler som saknar coronin A är oförmögna att bilda flercelliga aggregat, och denna defekt kan räddas genom att tillföra pulser av cAMP, vilket antyder att coronin A akter uppströms om cAMP kaskad 10. De tekniker som beskrivs i dessa studier ger robusta verktyg för att undersöka funktioner av proteiner under de inledande skedena av utvecklingscykeln av Dictyostelium discoideum uppströms cAMP kaskad. Därför kan utnyttja denna aggregering analys tillåta ytterligare studier av coronin En funktion och förbättra vår förståelse av coronin biologi.
Introduction
Den coronin familj av proteiner är mycket konserverad hela eukaryoter. Dessa proteiner kännetecknas av närvaron av en aminoterminal tryptofan-aspartat (WD) upprepa-innehållande regionen följt av en unik region som är ansluten till en karboxiterminal coiled-coil domain 13,14 (Figur 1). Coronins har varit inblandade i en mängd olika cellfunktioner, inklusive cytoskelettala reglering och signaltransduktion 12. I däggdjur, upp till sex korta coronin molekyler (coronin 1-6) samt en "tandem" coronin 7, kan samuttryckas 12,15. Coronin ett är den mest omfattande studerade familjemedlem, och visade sig vara inblandade i patogen förstörelse, T-cellöverlevnad och neuronal signalering. Hur exakt, coronin en utför dessa aktiviteter är fortfarande oklart. Medan coronin en visades reglera Ca2 + och cAMP-beroende signalering liksom F-aktin cytoskelettet module 16-18, den potentiella co-expression på upp till 7 familjemedlemmar i däggdjur har gjort det svårt att studera den molekylära funktionen av coronins i dessa system, på grund av potentiella uppsägningar. Till skillnad från däggdjursorganismer, uttrycker lägre eukaryot Dictyostelium discoideum endast två coronin familjemedlemmar (coronin A, den ortolog av däggdjurs coronin en och coronin B, den ortolog av däggdjurs coronin 7) med till synes icke-redundanta funktioner 15,19,20. Detta faktum gör Dictyostelium discoideum en potent modell för att studera funktionen av coronins.
För att studera den roll som coronin A i Dictyostelium discoideum, inducerade vi utvecklingscykeln genom svält i vävnadsodlingsplattor innehållande balanserad saltlösning (BSS) buffert med användning av antingen vildtyp-celler eller celler som saknar coronin A 10. Vi fann att celler som saknar coronin A kunde inte bilda flercelliga aggregat vid svält. För en exakt kvantitativ bedömning av denna fenotyp denautomatiserad levande cell imaging beskrivs i detta protokoll är ett viktigt verktyg. Defekten i inledandet av tidig svält svar i celler som saknar coronin A kan räddas genom att tillföra pulser av cAMP, vilket tyder på att coronin A agerar uppströms cAMP kaskad. Den exogena tillämpning av cAMP pulser för att simulera inledandet av utvecklingen har använts av flera laboratorier under de senaste 8,9. Emellertid är detta förfarande också känt för att vara starkt beroende av celldensiteter och timing. Därför det protokoll som beskrivs här syftar till att minska dessa variabilitet i syfte att garantera en hög grad av reproducerbarhet. Sammantaget teknikerna som används i dessa studier ger robusta verktyg för att undersöka funktioner av proteiner under tidiga skeden av utvecklingscykeln av Dictyostelium discoideum och har potential att identifiera upp- liksom nedströms effektorer av coronin En funktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
De coronin proteiner som finns i de flesta taxa av den eukaryota clade. Dictyostelium discoideum coronin A, homolog av däggdjurs coronin 1, är involverad i den tidiga svält svar, eftersom coronin A-bristande celler inte är i stånd att bilda aggregering centra under den tidiga utvecklings cykel 10. För att kunna kvantitativt och exakt bedöma fördröjningen i utvecklingen mellan stammarna, är ett mikroskop levande cell imaging set-up med den automatiserade steget styrenheten ett viktigt verkty…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Dictyostelium Stock Center for strains and reagents. This study was financed by grants from the Swiss National Science Foundation and the Canton of Basel.
Materials
| HL-5 media (for 1L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4∗2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6) | |||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 211693 | |
| Thiotone E peptone | BD Bioscience | 211684 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| Glucose | AppliChem | A3666 | |
| Na2HPO4∗2H2O | Fluka | 71643 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1043 | |
| dihydrostreptomycin-sulfate | Sigma-Aldrich | D1954000 | |
| PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 μM CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1) | self made | ||
| BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5) | self made | ||
| 0.45-μm Filtropure S filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Falcon 24-well Tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| Cellobserver microscope | Zeiss | custom built | |
| AxioVision software | Zeiss | ||
| IPC Microprocessor–controlled dispensing pump | ISMATEC | ISM 931 | |
| Axiovert 135M microscope | Zeiss | 491237-0001-000 | |
| Incubation Shaker | Inforst HT Minitron |
References
- Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
- Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
- Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
- Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
- Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
- Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
- Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
- Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
- Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
- Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268 (2011).
- Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
- Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
- Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
- Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
- Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820 (2014).
- Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
- Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
- de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
- Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
- Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
- Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
- Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
- Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
- Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).
