Metoder til at studere Mrp4-holdige Makromolekylær Komplekser i forordningen af fibroblast Migration
Summary
MRP4 regulerer forskellige cykliske nukleotid-afhængig signalering arrangementer, herunder en nylig belyst rolle i celle migration. Vi beskriver en direkte, men flerstrenget tilgang at optrævle de nedstrøms molekylære mål for MRP4 resulterer i identifikation af et unikt MRP4 interactome der spiller centrale roller i finjusteret regulering af fibroblast migration.
Abstract
Multilægemiddelresistens protein 4 (MRP4) er et medlem af ATP-bindende kassette-familien af membrantransportører og er en endogen efflukstransporteren af cykliske nukleotider. Ved at modulere intracellulær cyklisk nukleotid koncentration, kan MRP4 regulere flere cykliske nukleotid-afhængige cellulære begivenheder, herunder celle migration. Tidligere påviste vi, at i fravær af MRP4, fibroblastceller indeholder højere niveauer af intracellulære cykliske nukleotider og kan migrere hurtigere. For at forstå de underliggende mekanismer af dette fund, vedtog vi en direkte alligevel flerstrenget tilgang. Først, vi isoleret potentielle interagerende protein komplekser af MRP4 fra en MRP4 overekspression celle system ved hjælp af immunpræcipitation efterfulgt af massespektrometri. Efter identifikation unikke proteiner i MRP4 interactome, vi udnyttet Ingenuity Pathway Analysis (IPA) for at undersøge den rolle, disse protein-protein interaktioner i forbindelse med signaltransduktion. Vi belyst den potiale rolle MRP4 proteinkompleks i cellemigrering og identificeret F-actin som en vigtig mediator af virkningen af MRP4 på cellemigrering. Denne undersøgelse understregede også betydningen af cAMP og cGMP som centrale aktører i de vandrende fænomener. Ved hjælp af høj-indhold mikroskopi, udførte vi celle-migration assays og observerede, at virkningen af MRP4 på fibroblast migration er helt afskaffet ved afbrydelse af actincytoskelettet eller inhibering af cAMP-afhængig kinase A (PKA). At visualisere signalering modulationer i en vandrende celle i realtid, vi udnyttet en FRET-baseret sensor til måling PKA aktivitet og fandt, at tilstedeværelsen af mere polariseret PKA aktivitet nær forkanten af migrerende Mrp4 – / – fibroblast, sammenlignet med Mrp4 + / + fibroblaster. Dette vil til gengæld øget kortikal actin dannelse og augmented processen med migration. Vores tilgang gør det muligt at identificere de proteiner, der virker nedstrøms til MRP4 og giver os en overbetragtning af den involveret i MRP4-afhængig regulering af fibroblast migration mekanisme.
Introduction
Cell migration er en kompliceret multi-trins proces. Undersøgelser har vist, at under migration celler polariseret i for- og bagkanten. Ved at følge den ekstracellulære matrix, den førende kant giver trækkraft er nødvendig for cellen kroppen at bevæge sig fremad. Endelig efterstillede kant udgivelser bag vedhæftede filer og fuldender migration cyklus 1,2.
Cell polarisering til effektiv cellemigration reguleres af rumlig adskillelse af intracellulær signalering. Cellular second messengers, såsom cAMP, mægle opdeling af signalering begivenheder, der kræves for finjusteret retningsbestemt celle migration 3,4. Differentieret ophobninger af cAMP og cAMP-afhængig kinase PKA aktivitet på forkant spiller nøgleroller i retningsbestemt cellemigration 5,6. Ved phosphorylering små GTPaser såsom Ras-relateret C3 botulinustoksin substrat (Rac) og celledeling kontrolprotein 42 homolog eller Cdc42, PKA aktiverer actin-relateret protein 2/3 (Arp 2/3) ved forkanten og inducerer dannelsen af lamellipodia 7-9. PKA phosphorylerer også en anti-capping agent, vasodilator stimuleret phosphoprotein (VASP), derved regulerer oscillerende cyklusser af membran udvidelse og tilbagetrækning 10,11.
I celler, der cAMP-niveauer reguleres af tre hovedprocesser: i) syntese ved adenylatcyclase, ii) nedbrydning af phosphodiesteraser, og iii) transport af membranbundne effluxtransportører 3. Multilægemiddelresistens protein 4 (MRP4), et medlem af ATP-bindende kassette (ABC) familie af membrantransportører, funktioner som en endogen efflukstransporteren af cykliske nukleotider. Derfor kan MRP4 regulere intracellulære cAMP-niveauer og cAMP-afhængig cellulær signalering 11-13. Vi har tidligere vist, at i Mrp4 – / – fibroblaster indeholder relativt højere niveauer af cykliske nukleotider og migrere hurtigere compared til Mrp4 + / + fibroblaster 14. Vi rapporteret også en bifasisk effekt af cykliske nukleotider på fibroblast migration. Baseret på tidligere studier og vores fund, at Mrp4 – / – fibroblaster indeholder mere polariseret cAMP i løbet af migration, vi hypotese, at dette MRP4-medieret regulering af fibroblast migration er cAMP-afhængig. For at forstå den nedstrøms mekanisme, tog vi en direkte alligevel flerstrenget tilgang.
For at identificere de proteiner, der er forbundet og i samspil med MRP4, vi immunopræcipiterede MRP4-holdige makromolekylære komplekser fra HEK293 celler at over udtrykker MRP4. Brug massespektrometri, identificerede vi flere MRP4-interagerende proteiner og analyseret deres sammenkobling hjælp Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA er et nyttigt værktøj til at analysere protein-protein interaktioner (både strukturelle og funktionelle) og udforske deres bidrag, især fysiologiske og patologiskebegivenheder baseret på litteraturen og eksperimentelle beviser 15,16. IPA indikerede, at F-actin er et stort nedstrømsmål af MRP4 i forbindelse med cellemigrering hvor cAMP og cGMP er nøglen signalmolekyler 17. Disse data blev yderligere bekræftet ved højinformativ mikroskopi. High-indhold mikroskopi kan fange og analysere celle adfærd, såsom celle migration i en mere bekvem, nøjagtig og high-throughput måde 18. De høje-indhold mikroskopi data viste, at virkningen af MRP4 på fibroblast migration er helt afskaffes ved afbrydelse af actincytoskelettet eller inhibering af PKA 17.
Desuden har vi brugt en Forster resonans (FRET) -baserede PKA sensor til at overvåge PKA dynamik i migrerende celler i realtid. FRET-baserede kinase sensorer består normalt af specifikke phosphoryleringssubstrat peptider flankeret af den fælles fiskeripolitik og YFP fluoroforer 19-21. pmAKAR3 er en forbedret og migmbrane målrettet FRET-baserede PKA sensor, der indeholder forkhead-associerede domæne 1 (FHA1) og PKA substrat sekvens LRRATLVD 5,22. Phosphorylering af pmAKAR3 af PKA katalytiske subunit stigninger FRET signal mellem FFP og YFP 19. Indsættelse af et lipid modifikation domæne ind i sensoren målretter det til plasmamembranen til overvågning PKA dynamik, specielt mod membranen kammer 23.
Brug af pmAKAR3, demonstrerede vi at forkanten migrere Mrp4 – / – fibroblaster udviste mere polariseret PKA aktivitet end Mrp4 + / + fibroblaster, som igen udbyggede kortikale actin formationen ved cellens førende kant 17. Tilsammen udgør disse begivenheder resulterede i bedre cellulær polarisering og hurtigere retningsbestemt celle migration i fravær af MRP4. Vores specifikke og direkte tilgang identificeret vigtige downstream mål for MRP4 og giver en vigtig, men somendnu uudforskede mekanisme til MRP4-afhængig regulering af fibroblast migration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35-mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
References
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why?. Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
- Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
- Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
- Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
- Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
- Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
- Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
- Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
- Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
- Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
- Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
- Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer’s disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
- Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
- Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer – an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
- Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
- Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
- Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
- Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
- Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
- Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
- Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).
