Métodos para estudar MRP4 contendo Complexos Macromoleculares no regulamento de Fibroblasto Migração
Summary
MRP4 regula vários eventos de sinalização dependentes de nucleótidos cíclicos, incluindo um papel recentemente elucidados na migração de células. Nós descrevemos uma abordagem direta, mas multifacetada para desvendar os alvos moleculares jusante de MRP4 resultando em identificação de um interactome MRP4 única que desempenha um papel-chave na regulação afinado da migração de fibroblastos.
Abstract
Multidrug proteína de resistência 4 (MRP4) é um membro da família de cassete de ligação de ATP dos transportadores de membrana e é um transportador de efluxo endógena de nucleótidos cíclicos. Modulando concentração de nucleótido cíclico intracelular, MRP4 pode regular vários eventos celulares dependentes de nucleotídeos cíclicos, incluindo a migração celular. Anteriormente, foi demonstrado que na ausência de MRP4, células de fibroblasto de conter níveis mais elevados de nucleótidos cíclicos intracelulares e pode migrar rapidamente. Para entender os mecanismos subjacentes a este achado, adotamos uma abordagem direta ainda multifacetada. Em primeiro lugar, foram isoladas potenciais complexos de proteínas interactuantes de MRP4 a partir de um sistema de célula de MRP4 sobre-expressão usando imunoprecipitação seguida por espectrometria de massa. Após a identificação de proteínas específicas no interactoma MRP4, utilizou Engenho Pathway Analysis (IPA) para explorar o papel destas interacções proteína-proteína no âmbito da transdução de sinal. Nós elucidou o potencial papel do complexo de proteína de MRP4 na migração celular e identificado F-actina como um importante mediador do efeito de MRP4 sobre a migração celular. Este estudo também enfatizou o papel da cAMP e cGMP como jogadores-chave nos fenómenos migratórios. Utilizando microscopia de elevado teor, realizamos ensaios de migração celular e observou-se que o efeito de MRP4 sobre a migração de fibroblastos é completamente abolida por disrupção do citoesqueleto de actina ou a inibição da cinase A dependente de AMPc (PKA). Para visualizar sinalização modulações numa célula migrar em tempo real, que utilizado um sensor baseado em TERF para medir a actividade de PKA e encontrado, a presença de actividade de PKA mais polarizada perto do bordo de ataque da migração de MRP4 – / – de fibroblastos, em comparação com MRP4 + / + fibroblastos. Este por sua vez, o aumento na formação de actina cortical aumentada e o processo de migração. A nossa abordagem permite a identificação das proteínas que actuam a jusante para MRP4 e fornece-nos com um excessovista do mecanismo envolvido na regulação dependente de MRP4 da migração de fibroblastos.
Introduction
A migração celular é um processo multi-passo complicado. Estudos têm demonstrado que durante a células de migração são polarizada em bordos de ataque e de fuga. Ao aderir à matriz extracelular, o bordo de ataque fornece a força necessária para o corpo da célula para se mover para a frente. Finalmente, os acessórios traseiros de arrasto lançamentos de ponta e completa o ciclo de 1,2 a migração.
polarização celular para a migração celular eficiente é regulada pela segregação espacial de sinalização intracelular. Segundos mensageiros celulares, tais como cAMP, mediar a compartimentalização dos eventos de sinalização requeridos para a migração de células 3,4 afinadas direccional. Acumulações preferenciais de cAMP e da atividade PKA quinase dependente de cAMP na vanguarda desempenham papéis fundamentais na migração celular direcional 5,6. Por fosforilação pequenas GTPases, como substrato relacionadas com Ras toxina botulínica C3 (RAC) e controle da divisão celular proteína 42 homólogo ou Cdc42, PKA ativa relacionada actina-proteína 03/02 (Arp 2/3) no bordo de ataque e induz a formação de lamelip�ios 7-9. PKA também fosforila um agente anti-capping, vasodilatador estimulado fosfoproteína (VASP), assim, regula os ciclos oscilatórios de extensão de membrana e retração 10,11.
Nas células, os níveis de cAMP são regulados por três processos principais: i) síntese de guanilato ciclase, ii) degradação por fosfodiesterases, e iii) o transporte por transportadores de efluxo ligada à membrana 3. proteína de resistência a múltiplas drogas 4 (MRP4), um membro da cassete de ligação a ATP (ABC) da família de transportadores de membrana, funciona como um transportador de efluxo endógena de nucleótidos cíclicos. Portanto, MRP4 pode regular os níveis de AMPc intracelular e celular dependente de AMPc sinalização 11-13. Temos anteriormente demonstrado que, em MRP4 – / -, os fibroblastos contêm níveis relativamente elevados de nucleotídeos cíclicos e migrar c mais rápidoompared para MRP4 fibroblastos + / + 14. Nós também relataram um efeito bifásico de nucleotídeos cíclicos sobre a migração de fibroblastos. Com base em estudos anteriores e nossa conclusão de que MRP4 – / – fibroblastos conter cAMP mais polarizada durante o curso da migração, a hipótese de que este regulamento mediada por MRP4 da migração de fibroblastos é cAMP dependente. A fim de compreender o mecanismo a jusante, fizemos uma abordagem direta ainda multifacetada.
Para identificar as proteínas associadas e na interação com MRP4, nós imunoprecipitadas complexos macromoleculares contendo MRP4 de células HEK293 que mais expressam MRP4. Utilizando espectrometria de massa, foram identificadas várias proteínas interagindo MRP4 e analisados sua interconectividade usando Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA é uma ferramenta útil para analisar as interações proteína-proteína (tanto estruturais e funcionais) e explorar as suas contribuições em particular fisiológico e patológicoacontecimentos com base na literatura e evidências experimentais 15,16. IPA indicou que a actina F é um dos principais alvos a jusante de MRP4 no contexto da migração celular em que cAMP e cGMP são a chave 17 moléculas de sinalização. Estes dados foram confirmados por microscopia de elevado teor. Microscopia de elevado teor podem capturar e analisar o comportamento de células, tais como migração de células de um modo mais conveniente, preciso e de alto rendimento 18. Os dados de alto teor de microscopia demonstraram que o efeito de MRP4 sobre a migração de fibroblastos é completamente abolida mediante a interrupção do citoesqueleto de actina ou inibição da PKA 17.
Além disso, utilizou-se uma transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) à base de PKA do sensor para controlar a dinâmica de PKA em células migrantes em tempo real. Sensores de quinase baseados em FRET geralmente consistem de péptidos substrato de fosforilação específicos flanqueadas por PCP e YFP fluoróforos 19-21. pmAKAR3 é uma melhorada e membrane alvo sensor de PKA baseado em FRET que contém domínio associado-forkhead 1 (FHA1) e a sequência de substrato PKA LRRATLVD 5,22. A fosforilação de PKA pmAKAR3 pelos aumentos de subunidades catalíticas FRET sinal entre PCP e YFP 19. A inserção de um domínio modificação lipídica no sensor que tem como alvo a membrana plasmática para o monitoramento da dinâmica de PKA, especificamente no compartimento da membrana 23.
Usando pmAKAR3, demonstramos que a vanguarda de migrar MRP4 – / – fibroblastos exibiram atividade PKA mais polarizada do que MRP4 + / + fibroblastos, que por sua vez aumentou a formação de actina cortical na vanguarda da célula 17. Juntos, estes eventos resultou no melhor polarização celular e migração celular mais rápido direccional na ausência de MRP4. A nossa abordagem específica e diretamente identificados alvos a jusante-chave para MRP4 e fornece uma importante, mas comodo ainda inexplorado mecanismo para a regulação dependente de MRP4 da migração de fibroblastos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35-mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
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